桑葚縮小型菌核病病原學及其分子檢測體系.pdf

1、桑葚菌核病是重要的果桑病害，并且是制約果桑產(chǎn)業(yè)的重大障礙。通過表現(xiàn)的癥狀可以將桑葚菌核病分為三種:肥大、縮小和小粒型。桑實杯盤菌、肉阜狀杯盤菌和核地杖菌被認為是引起桑葚菌核病的病原。但是，病原菌和病害類型之間的關系尚不清楚，且缺乏病原菌形態(tài)學和生物學方面的信息。仍然沒有一種分子方法來檢測病原菌和診斷病害。在本試驗中，鑒定了桑葚縮小型菌核病菌，并研究了其生物學特性。利用SCAR-PCR建立了一個檢測桑葚縮小型菌核病菌的分子檢測系統(tǒng)。

2、>　　1、桑葚縮小型菌核病菌的分離和鑒定:對2012-2014年采集的247個樣品進行病原菌的分離。用組織分離法和孢子萌發(fā)法均沒有獲得真菌純培養(yǎng)。用保濕培養(yǎng)法從25個桑病果樣品中分離到5個純的病原菌，分離率為20％。赫氏證病法證明，所獲得5株真菌均為病原菌。通過結合采用形態(tài)學和分子生物學方法進行鑒定，以及致病性測試確定分離出的病原菌菌株均為引起桑葚縮小型菌核病的核地杖菌(Scleromitrula shiraiana)。
　　2、

3、核地杖菌的形態(tài)學特征:在單個菌核上長出1至數(shù)個子實體，子實體有長柄，柄部扁平稍扭曲，灰褐色，長有茸毛。子實體的頭部為紡錘形，有若干條縱行褶皺。子囊生于頭部外面的子實層中，大小為4-6μm×53-68μm，內(nèi)含8個子囊孢子。子囊孢子呈橢圓形，一端略尖，無色透明，大小2.3-4.2μm×4.8-9.7μm。其分生孢子梗細絲狀具分枝，端生卵至橢圓形、無色單胞型分生孢子。SS1-SS5菌落都呈灰白色，邊緣不規(guī)則，后期在菌落表面形成粘稠狀的小孢子

4、堆，病原菌接觸的培養(yǎng)基表面形成堅硬的一層不明物質(zhì)。小孢子短橢圓形，單孢，大小1.8-2.2μm×4.3-4.9μm。
　　3、核地杖菌的生物學特性:測試了8種培養(yǎng)基，核地杖菌的最適培養(yǎng)基為綠豆培養(yǎng)基和桑葉培養(yǎng)基，病原菌在PDA培養(yǎng)基上的生長速度非常緩慢，10d菌落直徑僅能達到37.68 mm。核地杖菌生長適宜的溫度為5-35℃，最適溫度為25℃。核地杖菌在pH4-11的MBDA培養(yǎng)基上均能生長，最適酸度為pH7.0。在供試的7種碳

5、源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、菊糖和甘露醇）中，核地杖菌對葡萄糖和甘露醇利用最好。在供試的7種氮源中，核地杖菌對胰蛋白胨利用最好，在以硝酸鉀、硝酸銨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上生長相對正常，磷酸銨和硫酸銨對核地杖菌的生長有輕微的抑制作用。
　　4、核地杖菌對殺菌劑的敏感性:試驗選用了7種常用殺菌劑（85％戊唑醇、5％井岡霉素、25％咪鮮胺、70％甲基硫菌靈、10％苯醚甲環(huán)唑、40％菌核凈和1％武夷菌素），分別以不同濃度加入到M

6、BDA培養(yǎng)基中。結果顯示它們的EC50分別為0.0132μg/mL、0.1516μg/mL、0.1809μg/mL、0.2028μg/mL、0.7867μg/mL、1.4634μg/mL和5.3400μg/mL，以戊唑醇對核地杖菌抑制作用最強。
　　5、核地杖菌的分子檢測體系的建立:本試驗利用SCAR-PCR成功建立了一個分子檢測系統(tǒng)用于核地杖菌的檢測。
　　(1)RAPD特異引物的篩選。利用RAPD技術，用40條隨機引物擴

7、增核地杖菌，篩選出4條條帶清晰且穩(wěn)定擴增的隨機引物用于擴增供試菌株篩選特異隨機引物，4條隨機引物中，只有CS23能夠在核地杖菌中產(chǎn)生兩條特異性的條帶。因此，CS23(5'-CGCAGCCGAGAT-3')是核地杖菌特異的隨機引物。
　　(2)SCAR特異引物的篩選:將這兩條特異性的條帶回收和測序用于特異性SCAR引物的篩選，從中設計了20對引物，篩選出一條理想的SCAR引物對SS-F/SS-R，上游引物為5'-AGTAAAGAGA

8、ACATCAAACTTCG-3'，下游引物為5'-ACTTCCACCGACCAATCT-3'。
　　(3)檢測體系的優(yōu)化:通過對PCR反應體系中退火溫度及各個組分(Mg2+、dNTPs、引物和rTaq酶)的濃度進行優(yōu)化，得到一個優(yōu)化的擴增體系。優(yōu)化的擴增體系為:2.5μL10× PCR Buffer;2.25μL Mg2+(25 mmol/L);2.5μL dNTPs(2.5 mmol/L);0.625μL引物SS-F/SS-R(

9、10μmol/L);1μL模板(10 ng/μL);0.2 U rTaq酶;ddH2O補足至25μL。反應程序為:94℃預變性5 min;94C變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次;72℃補充延伸5 min。
　　(4)檢測體系的特異性驗證:利用引物對SS-F/SS-R和優(yōu)化的檢測體系擴增10個相關菌株的基因組DNA。結果表明:所有的核地杖菌菌株都擴增出了一條590 bp的條帶，而其它9種真菌沒有擴增出

10、條帶。也就是說，只有核地杖菌呈陽性反應。因此，建立的SCAR-PCR系統(tǒng)可以特異的檢測核地杖菌。
　　(5)檢測體系的靈敏度檢測:將核地杖菌的基因組DNA從10 ng/μL開始依次10倍稀釋至1fg/μL，得到不同的DNA濃度(10 ng，1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100fg，10fg and1 fg/μL)，各濃度取1μL為模板利用優(yōu)化的體系進行擴增。結果顯示，特異的條帶能從濃度為1 pg/μL及以上濃度擴增

11、出來，表明該檢測系統(tǒng)對于檢測核地杖菌是非常靈敏的。
　　6、SCAR-PCR檢測系統(tǒng)的應用:試驗建立的SCAR-PCR檢測系統(tǒng)可以用于接種桑葚和田間樣品的檢測以及桑葚縮小型菌核病的診斷。
　　(1)接菌桑葚的快速檢測:于2月下旬將桑樹枝用硫酸紙袋套袋，套袋后待雌花柱頭剛開始膨大時進行接種試驗。用檢測體系對2-5 d采集的桑葚樣品(未顯癥)DNA和第30 d采集的桑葚（顯癥）以及健康桑葚DNA進行PCR擴增。結果顯示，檢測體系

12、可以從接種2d及之后的桑葚中檢測出病原菌的存在，而沒有接種的樣品則檢測不出。表明建立的檢測系統(tǒng)用于檢測核地杖菌是可靠的，此檢測體系可用于桑葚縮小型菌核病的早期檢測。
　　(2)檢測體系的田間檢測:試驗檢測2個花期桑葚、3個不同發(fā)病形態(tài)的病果、1個桑樹根、2個桑樹莖、2個桑樹葉和12份隨機采集的土樣，結果顯示，在這些樣品中，只有癥狀為縮小的病果呈陽性，而其它樣品呈陰性。表明試驗建立的檢測體系在桑田范圍內(nèi)能夠準確的鑒定和檢測桑葚縮小型

13、菌核病菌。
　　(3)檢測體系用于病害診斷:通過人工將從田間采集的病樣分為8個縮小狀和8個腫大狀的樣品，用檢測系統(tǒng)擴增這些樣品DNA。結果顯示5個縮小狀和1個腫大狀的樣品呈陽性，而其它樣品呈陰性。顯示出人工診斷和分子診斷結果不一樣，表明SCAR-PCR診斷更準確、可靠和實用。
　　最后，桑葚縮小型菌核病是由核地杖菌引起。成功建立一個SCRA-PCR檢測系統(tǒng)并測試了接種的樣品和田間樣品。該檢測系統(tǒng)非常特異、靈敏、可靠和準確。這