馬紅球菌病血清學(xué)與病原學(xué)檢測(cè)方法的建立及其流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、馬紅球菌（Rhodococcus equi）是馬群聚居地常見(jiàn)的一種存在于土壤中的兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽(yáng)性球桿菌，可導(dǎo)致馬駒亞急性或慢性化膿性支氣管肺炎和廣泛性肺部膿腫。馬紅球菌病致死率可達(dá)80％以上，可對(duì)馬場(chǎng)乃至馬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，我國(guó)R. equi的報(bào)導(dǎo)幾乎為零，缺乏標(biāo)準(zhǔn)的病原以及血清流行病學(xué)調(diào)查方法。最近報(bào)導(dǎo)，R. equi毒力相關(guān)脂蛋白A（VapA）是唯一的與細(xì)菌毒力相關(guān)的膜表面脂蛋白，可作為致病性R. equi

2、的標(biāo)志性抗原。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建表達(dá)VapA重組蛋白（rVapA），建立了檢測(cè)致病性R. equi血清抗體的間接ELISA檢測(cè)方法以及檢測(cè)土壤中致病性與非致病性R. equi的菌落印記方法，并對(duì)我國(guó)馬群及馬聚居地R. equi進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，為我國(guó)馬紅球菌病的防治提供技術(shù)支持、數(shù)據(jù)支撐和理論基礎(chǔ)。
　　首先，本研究選用pMAL-c5x原核表達(dá)體系，通過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化，融合表達(dá)了可溶性rVapA，經(jīng)WB驗(yàn)證，其具有良好的反應(yīng)原性

3、。
　　其次，以純化的rVapA作為包被抗原，經(jīng)條件優(yōu)化，構(gòu)建了致病性R. equi血清抗體間接ELISA檢測(cè)方法，陽(yáng)性臨界值為0.370。經(jīng)特異性、重復(fù)性及敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明，其與H3N8馬流感、馬鼻肺炎、馬傳染性貧血抗血清無(wú)交叉反應(yīng)，且批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于15%，具有較好的特異性、重復(fù)性和敏感性。采用該方法，首次對(duì)我國(guó)部分地區(qū)馬匹進(jìn)行R. equi血清流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明，致病性R. equi血清抗體總體陽(yáng)性率高達(dá)53

4、.93%，且抗體水平呈顯著的地區(qū)性差異，存在品種、性別和季節(jié)特點(diǎn)，而與年齡無(wú)關(guān)。
　　最后，本研究使用兔抗非致病性R. equi多抗以及兔抗致病性R. equiVapA蛋白多抗，并通過(guò)條件優(yōu)化，構(gòu)建了可用于R. equi檢測(cè)并區(qū)分致病性與非致病性R. equi的菌落印記檢測(cè)方法。與細(xì)菌分離鑒定及R. equiPCR鑒定方法相比，該檢測(cè)方法具有敏感性高、特異性好、檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)。采用該方法對(duì)我國(guó)部分地區(qū)馬場(chǎng)土壤中R. equi進(jìn)行流

5、行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明，R. equi在馬場(chǎng)土壤中的分布與馬匹活動(dòng)有關(guān)，所有土壤樣本采集馬場(chǎng)均可分離鑒定出R. equi，土壤中R. equi的平均陽(yáng)性率為43.21%，未發(fā)現(xiàn)致病性R. equi。
　　本研究獲得融合表達(dá)rVapA蛋白，為R. equi致病機(jī)制研究提供材料基礎(chǔ)，并為馬紅球菌病的診療方法的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究建立的間接 ELISA檢測(cè)方法以及菌落印記檢測(cè)方法為馬紅球菌病流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。本研究獲得的全國(guó)馬