莖點(diǎn)霉Phoma活性及檢疫性莖點(diǎn)霉小分子多肽檢測技術(shù)研究.pdf

1、檢疫性Phoma寄主范圍極為廣泛，危害豆科、十字花科、茄科等幾十個屬的上百種植物，能侵染寄主各個部位。導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低，甚至死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文在深入研究了莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）、豌豆莖點(diǎn)霉（Phoma pinodes）、豌豆腳腐病菌（P.pinodella），葡萄莖枯病菌（P.glomerata）等12個種共21個菌株的生物學(xué)特性基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對Phoma孢子活性染色方法和P.p

2、inodella、P.glomerata、P.terrestris、P.tracheiphila四種Phoma檢疫性代表種小分子多肽的檢測鑒定方法進(jìn)行了研究，探索出Phoma孢子活性染色方法及檢疫性Phoma小分子多肽檢測方法，研究結(jié)果如下：
　　Phoma屬12個種21個菌株的生物學(xué)特性研究表明，Phoma菌株在菌落形態(tài)、生長速度、產(chǎn)孢等方面有顯著差異，其中檢疫性豌豆腳腐病菌（P.pinodella）種內(nèi)菌落形態(tài)也有較大差異，菌

3、落圓形，白色、棕色、紅棕色，部分呈淺黃色、黑色和墨綠色等。分生孢子單孢、無色或淺綠色，透明、薄壁，球形、橢圓形或長桿狀，部分梨形，少量菌株孢子有一個或兩個油球。分生孢子器球形、近球形，外壁呈黑色或褐色。
　　通過孢子萌發(fā)時(shí)間、致死溫度、活性染色所需染料種類、濃度、染色時(shí)間等條件的篩選，確定了P.glomerata、P.errestris2種檢疫性莖點(diǎn)霉的孢子致死溫度為52℃和50℃。根據(jù)碘化丙啶染料使死細(xì)胞與活細(xì)胞在不同波長激光光

4、源激發(fā)下產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不同，篩選出使用濃度為1mg/ml的PI染液能夠明顯區(qū)分死孢子和活孢子。建立Phoma的孢子活性檢測方法，并對該方法進(jìn)行了重復(fù)性驗(yàn)證。
　　以PD液體培養(yǎng)五天的P.glomerata、P.pinodella、P.terrestris、P.tracheiphila四個代表種用勻漿+SDT裂解法提取蛋白后，進(jìn)行iTRAQ分析，確定了四種檢疫性Phoma真菌種的差異蛋白。以篩選標(biāo)準(zhǔn)Ratio>2且P<0.05，刪除

5、預(yù)測蛋白，篩選出四組樣品中特異性表達(dá)蛋白數(shù)目分別為33、17、41、16種。其中差異顯著的蛋白主要為葡萄莖枯病菌株中的Dipeptidyl-peptidase5、50Sribosomal protein L6、Scytalone dehydratase、Methylthio-ribulose-1-phosphate dehydratase、1,3,6,8-tetrahyd roxynaphthalene reductase蛋白；豌豆腳腐

6、病菌株中的Diaminopropionate ammonialyase、SURF-family protein Shy1、Ankyrin repeat and SAM domain containing protein6、Conidialyellow pigment biosynthesis polyketide synthase、3'-phosphoadenosine5'-phosphatase isoform A、Mycoceros

7、ic acid synthase蛋白；大蔥抗粉根病菌株中的Translationally-controlled tumor protein、ATP-dependent RNA helicase DBP5、Acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex、Probable Xaa-Pro aminopeptidase PEPP、Delta(12)fatty acid