大腸桿菌F18菌毛FedF亞單位單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用.pdf

1、仔豬水腫病(ED)和斷奶仔豬腹瀉(PWD)是由表達(dá)F18菌毛的大腸桿菌引起的仔豬常見(jiàn)的兩種傳染病，在養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)中危害很大。細(xì)菌利用自身的菌毛介導(dǎo)其在腸道內(nèi)的定居、繁殖，多數(shù)產(chǎn)生F18ab菌毛的菌株同時(shí)產(chǎn)生志賀毒素Ⅱ型變異體(STx2e或SLT-Ⅱv)引起腸毒血癥，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞以及小血管和毛細(xì)血管的平滑肌壞死，改變血管通透性，進(jìn)而仔豬出現(xiàn)水腫，當(dāng)腦部水腫壓迫神經(jīng)組織后，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀；產(chǎn)F18ac菌株常常產(chǎn)生不耐熱腸毒素(LT)或耐熱腸毒

2、素(ST)，也有些菌株帶有SLT-Ⅱv基因，當(dāng)其菌毛黏附素與小腸上皮細(xì)胞的微絨毛和細(xì)胞表面的受體相結(jié)合，并牢固地黏附于腸黏膜后，細(xì)菌定居、繁殖，產(chǎn)生并釋放大量腸毒素，對(duì)其靶細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，腸內(nèi)水鹽代謝平衡失調(diào)導(dǎo)致腹瀉。 F18菌毛蛋白結(jié)構(gòu)主要有六個(gè)部分：A、B、C、D、E、F。其中A亞單位是菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位，構(gòu)成菌毛的主干，B、C亞單位在菌毛的成熟、裝配及合成中起伴侶或推進(jìn)作用，F(xiàn)edE和FedF為F18菌毛黏附所必需，并

3、影響菌毛的長(zhǎng)度，如果兩個(gè)fedF和fedE發(fā)生突變，則會(huì)使菌毛長(zhǎng)度發(fā)生改變，同時(shí)也可能會(huì)使細(xì)菌喪失對(duì)小腸上皮細(xì)胞的吸附能力。 本研究利用融合蛋白(GST-FedF)制備免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，采用間接ELISA篩選出兩株穩(wěn)定分泌針對(duì)FedF亞單位的單克隆抗體C8，E7，ELISA效價(jià)分別為12log2，14log2。間接免疫熒光試驗(yàn)和小腸上皮細(xì)胞黏附阻抑試驗(yàn)結(jié)果表明抗FedF單抗不但具有識(shí)別F18

4、天然菌毛的生物活性，可以用于臨床檢測(cè)，而且能阻斷F18細(xì)菌對(duì)小腸上皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)一步論證此亞單位是F18菌毛的黏附功能單位；免疫膠體金試驗(yàn)可以看到金顆粒在菌毛表面上呈規(guī)律性分布，說(shuō)明所制備的單抗針對(duì)菌毛。 研究證明，表達(dá)菌毛的F18細(xì)菌都是通過(guò)FedF蛋白和腸上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合。通過(guò)對(duì)F18ab菌毛的fedF和fedE基因序列的分析，對(duì)不同的F18菌株進(jìn)行了基因克隆，發(fā)現(xiàn)FedF是F18菌毛的高度保守性亞單位，核苷酸序列同源