抗Neuropilin2單克隆抗體的制備鑒定及其初步應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　Neuropilin2(NRP2)是一種多功能的新型受體，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及淋巴管生成等過程中發(fā)揮重要作用。最新研究表明，NRP2受體廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，與腫瘤血管形成以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展、凋亡、粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。多種腫瘤細(xì)胞均高表達(dá)NRP2，提示NRP2可能成為一種新型腫瘤標(biāo)志物。NRP2通過多種機(jī)制調(diào)控腫瘤進(jìn)展，NRP2-b1b2是其發(fā)揮作用的重要結(jié)構(gòu)域，NRP2-b1b2

2、結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合配體Ⅲ型Semaphorin和VEGF，并調(diào)控它們介導(dǎo)的相關(guān)信號通路。本文旨在通過雜交瘤技術(shù)制備抗NRP2-b1b2片段的單克隆抗體，通過鑒定該抗體的特性并探索該抗體在實(shí)際中的應(yīng)用，為快速準(zhǔn)確地分析不同惡性程度的腫瘤細(xì)胞或組織中NRP2的表達(dá)情況提供有利條件，同時也為進(jìn)一步研究NRP2與腫瘤相關(guān)的信號通路奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　利用NRP2的b1b2片段(NRP2-b1b2)作為免疫原，免疫4-6周齡雌

3、性Balb/c小鼠，通過細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建可以穩(wěn)定分泌抗NRP2-b1b2的單克隆抗體.的雜交瘤細(xì)胞株。然后體外擴(kuò)大培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，接種于Balb/c小鼠腹腔中，獲得含有NRP2-b1b2單克隆抗體(NRP2 mAb)的腹水。通過rProtein A親和柱純化抗體;SDS-PAGE電泳分析抗體的純度;間接ELISA鑒定抗體的活性。采用流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting、細(xì)胞免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)以及免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)分

4、別檢測制備的單抗與結(jié)腸癌細(xì)胞株和移植瘤組織中NRP2蛋白的結(jié)合情況。免疫組織化學(xué)染色方法檢測腫瘤組織芯片中NRP2蛋白，分析NRP2蛋白在多種人腫瘤組織、配對癌旁組織以及不同分期的人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況。利用自制的NRP2 mAb建立定量檢測NRP2的夾心ELISA方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析方法的靈敏度和最低檢測限，檢測45例臨床腫瘤血清和3例正常血清樣本中NRP2的表達(dá)情況。MTT實(shí)驗(yàn)、集落形成抑制實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)檢測NRP2

5、抗體對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。
　　結(jié)果：
　　我們成功獲得了2株穩(wěn)定分泌NRP2 mAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為E4和C3。通過腹腔注射雜交瘤細(xì)胞得到的腹水經(jīng)rProteinA親和柱純化得到了純度較高的E4 mAb（純度約為95％，濃度約為2 mg/ml）;間接ELISA結(jié)果表明E4 mAb的滴度在5×10-5左右，具有較高的親和力。
　　WB結(jié)果顯示E4 mAb與NRP2-b1b2多肽及兩株結(jié)腸癌細(xì)胞株LoV

6、o、SW480總蛋白中的NRP2蛋白分別在34KDa、110KDa處有一結(jié)合條帶，說明抗體與線性的NRP2可以很好的結(jié)合，并具有較高的特異性;流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光和細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E4 mAb與結(jié)腸癌細(xì)胞自然存在的NRP2蛋白也可以很好地結(jié)合，并具有很高的特異性;免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明E4 mAb可以特異性地結(jié)合結(jié)腸癌細(xì)胞和移植瘤組織中的NRP2蛋白。組織芯片免疫組化結(jié)果顯示，NRP2在多種腫瘤組織及配對癌旁組織中均有不

7、同程度的表達(dá);在不同分期結(jié)腸癌中，NRP2的表達(dá)情況存在著差異。
　　應(yīng)用自制的E4 mAb和C3 mAb通過夾心ELISA建立了定量檢測NRP2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為Y=0.0025x+0.2605，相關(guān)系數(shù)R2=0.9885，線性檢測范圍是12.5-400ng/ml。批內(nèi)變異系數(shù)CV為5.72％，批間變異系數(shù)CV為7.33％，說明該檢測方法的特異性、重復(fù)性、可靠性均較好。利用建立好的夾心ELISA方法檢測45例臨床腫瘤血

8、清及3例正常血清樣本，結(jié)果表明不同腫瘤血清中所含的NRP2量不同。
　　MTT結(jié)果顯示NRP2 mAb能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和SW480的增殖，且抑制作用與劑量正相關(guān)。集落形成抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度抗體均可顯著抑制LoVo集落形成，并呈劑量依賴性。凋亡實(shí)驗(yàn)表明NRP2 mAb可誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡。遷移實(shí)驗(yàn)表明不同濃度抗體均可抑制LoVo細(xì)胞遷移，并呈劑量依賴性。
　　結(jié)論：
　　1.本研究通過雜交瘤技術(shù)成功獲得

9、了2株穩(wěn)定分泌NRP2 mAb的雜交瘤細(xì)胞株E4和C3，制備了大量純度高、親和力強(qiáng)的E4 mAb和C3 mAb。
　　2.經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)、WB、免疫熒光、細(xì)胞化學(xué)染色以及組織化學(xué)染色鑒定，E4 mAb能與人結(jié)腸癌細(xì)胞以及人結(jié)腸癌組織中NRP2蛋白特異性結(jié)合。
　　3.用E4 mAb驗(yàn)證了NRP2蛋白在多種人腫瘤組織芯片的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NRP2在一些腫瘤中表達(dá)上調(diào)，提示可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　4.應(yīng)用E4 mAb和C