胰島素受體（InsR）與奶牛酮病、脂肪肝糖異生和脂肪動(dòng)員的關(guān)系.pdf

1、以能量代謝障礙為病理學(xué)基礎(chǔ)的酮病和脂肪肝是奶牛在圍產(chǎn)期普遍發(fā)生的與肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)的營養(yǎng)代謝性疾病。胰島素受體(InsR)是靶細(xì)胞膜上的一種固有糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體家族，即具有受體自動(dòng)磷酸化激活的酪氨酸激酶活性，它在介導(dǎo)IGF-2和胰島素信號(hào)方面發(fā)揮著重要的作用，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物新陳代謝活動(dòng)。本文通過飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、體外肝細(xì)胞原代培養(yǎng)及定量RT-PCR方法，從細(xì)胞和分子水平，研究了圍產(chǎn)期奶牛能量代謝狀態(tài)、神經(jīng)內(nèi)分泌因子對(duì)圍產(chǎn)期正常奶牛、自然

2、發(fā)生酮病和脂肪肝病牛胰島素受體基因表達(dá)的調(diào)控作用及機(jī)理，為防治奶牛酮病和脂肪肝等圍產(chǎn)期能量代謝障礙性提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 在正常奶牛飼喂試驗(yàn)中，選取24頭5-8歲、3-5胎泌乳量大于5000Kg的妊娠荷斯坦奶牛，集中單槽飼養(yǎng)，預(yù)飼一周后進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)期由產(chǎn)前第28d至產(chǎn)后56d結(jié)束，按中國奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制的產(chǎn)奶日糧飼喂。產(chǎn)前奶牛每公斤日糧含1.79NND，產(chǎn)后各組奶牛常規(guī)方式飼喂精料，自由攝食干草，整個(gè)試驗(yàn)期間每日早、中和晚

3、定時(shí)飼喂。根據(jù)血糖水平，將整個(gè)試驗(yàn)期奶牛分為低血糖組和正常血糖組。在試驗(yàn)期產(chǎn)前28d、14d和產(chǎn)后1d、14d、28d及56d，分別采集血液，測(cè)定血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、血清游離脂肪酸(NEFA)、β-羥丁酸(BHBA)、總膽紅素(TBI)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、胰高血糖素(GN)、胰島素(INS)等指標(biāo)。在自然發(fā)病奶牛試驗(yàn)中，選取自然發(fā)生酮病牛10頭、脂肪肝病牛13頭和正常對(duì)照組13頭。分別采取血液，測(cè)定項(xiàng)目除上述指標(biāo)外，增

4、加了血清尿素氮(BUN)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)、膽堿酯酶(CHE)、肌酐(Cr)。采取肝組織和尾根部脂肪，同時(shí)稱量周體重(BW)、日平均泌乳量(MY)和日平均飼料消耗量，計(jì)算干物質(zhì)攝入量(DMI)。結(jié)果表明：①圍產(chǎn)期奶牛易發(fā)生低血糖，表明存在能量負(fù)平衡(NEB)，發(fā)生NEB的奶牛大多能在產(chǎn)后28d左右恢復(fù)正常；②圍產(chǎn)期奶牛血漿NEFA明顯增加，產(chǎn)后1d血漿NEFA、TBI濃度達(dá)最高，產(chǎn)后14d血清BHBA、AST達(dá)到最高，隨后逐

5、漸降低，說明圍產(chǎn)期分娩前后奶牛脂肪動(dòng)員先增強(qiáng)后減弱；圍產(chǎn)期奶牛發(fā)生NEB將加劇奶牛脂肪動(dòng)員，促進(jìn)亞臨床酮病的發(fā)生；③圍產(chǎn)期奶牛調(diào)節(jié)糖原異生、脂肪動(dòng)員的血液激素GN、INS及其INS/GN比率都逐漸降低，尤其INS/GN比值明顯下降(＜0.10)，啟動(dòng)了脂肪動(dòng)員和肝糖異生作用；④酮病、脂肪肝奶牛泌乳量明顯下降，血糖顯著降低，血漿NEFA和BHBA明顯增高；酮病、脂肪肝奶牛肝脂含量分別為18.8％和41.9％。酮病奶牛血清AST、γ-GT、

6、TBI、CHE等多項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，提示可能存在肝功能不全。脂肪肝奶牛血清AST、γ-GT、TBI、CHE等多項(xiàng)肝功能指標(biāo)明顯增高，表明其肝功能不全。血清Cr顯著升高，顯示腎功能可能也受到影響。 根據(jù)GENEBANK發(fā)表的牛InsR、β-actin的cDNA序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別成功擴(kuò)增出147bp的InsR基因片段和351bp的β-actin基因片段，分別構(gòu)建含牛InsR基因、β-actin基因的載體，測(cè)序結(jié)果InsR、

7、β-actin目的基因的同源性分別達(dá)到95％、100％。建立和優(yōu)化了肝InsRmRNA半定量RT-PCR檢測(cè)方法，其適宜的PCR反應(yīng)條件：退火溫度為60℃、Mg2+終濃度為2.4mmol/l、循環(huán)次數(shù)為30次、cDNA最小檢測(cè)限為5.2ng/ml，反應(yīng)體積25ul。選擇攝入不同能量的圍產(chǎn)期24頭奶牛的肝臟和脂肪組織，自然發(fā)生酮病奶牛、病死的脂肪肝奶牛和正常對(duì)照組圍產(chǎn)期奶牛各5頭的肝臟組織樣品，利用半定量RT-PCR檢測(cè)方法，觀測(cè)了Ins

8、R基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明：①干乳期高能飼喂，下調(diào)產(chǎn)后奶牛肝臟和脂肪組織InsRmRNA豐度，脂肪動(dòng)員增加，血液中NEFA及酮體濃度高，加重產(chǎn)后奶牛能量負(fù)平衡。干乳期低能飼喂，上調(diào)產(chǎn)后奶牛肝臟和脂肪組織InsRmRNA豐度，抑制脂肪動(dòng)員，促進(jìn)糖原合成，維持血糖濃度相對(duì)恒定，緩解機(jī)體能量負(fù)平衡，提高奶牛的生產(chǎn)性能。這些變化與血液INS、GN和INS/GN的變化有關(guān)。②酮病組奶牛InsRmRNA表達(dá)下降，提示此有利于酮病奶牛糖異生和脂肪動(dòng)員

9、，從而緩解能量負(fù)平衡；脂肪肝奶牛InsRmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，提示奶牛胰島素應(yīng)答顯著減弱，此時(shí)奶?？赡馨l(fā)生了胰島素抵抗。 同時(shí)，采用體外牛肝細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)和牛肝InsRmRNA半定量RT-PCR檢測(cè)方法，觀測(cè)了添加不同濃度的胰島素(0nmol/l、1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l、1000nmol/l)、胰高血糖素(0nmol/l、1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l、1000nmol