SIRT1基因與脂肪細(xì)胞胰島素受體的關(guān)系.pdf

1、背景與目的：
　　隨著經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展,人類飲食生活習(xí)慣的變化,肥胖及2型糖尿病的發(fā)病率在逐年升高,因此關(guān)于糖尿病及肥胖癥的研究現(xiàn)已成為生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。目前對(duì)糖尿病的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)已經(jīng)不單純停留在體內(nèi)胰島素缺乏的水平上,越來越多的研究證明,肥胖及其他因素造成的胰島素抵抗在糖尿病的發(fā)病中起著越來越重要的作用。
　　胰島素是哺乳動(dòng)物體內(nèi)促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的唯一激素,胰島素缺乏或者因抵抗導(dǎo)致的胰島素不敏感在糖尿病發(fā)

2、生中起重要作用。現(xiàn)已知胰島素在體內(nèi)要通過以下步驟發(fā)揮作用:胰島素到達(dá)相應(yīng)的靶細(xì)胞以后,與靶細(xì)胞膜表面的胰島素受體(insulin receptor, INSR)的α亞基結(jié)合,激活β亞基,導(dǎo)致受體自動(dòng)磷酸化,從而引起胰島素受體底物(Insulin receptor substrate,IRS)的酪氨酸磷酸化,磷酸化的 IRS-1可激活磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K),引起 PI3K的

3、活性升高,最終促進(jìn)糖的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)以及胰島素的其他功能。
　　在八十年代發(fā)現(xiàn)的沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Silent information regulator2,Sir2)是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)基因,可以延長(zhǎng)相當(dāng)多物種的壽命,它是與基因沉默及rDNA重組維持基因穩(wěn)定性相關(guān)的重要基因,具有組蛋白去乙?；钚浴Ｔ诓溉閯?dòng)物中Sir2有7個(gè)同源基因,分別命名為 SIRT1-SIRT7,它們?cè)诩?xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、抑制細(xì)胞凋亡及延長(zhǎng)細(xì)胞壽命等方面

4、都發(fā)揮著重要作用。近年來發(fā)現(xiàn) SIRT1在脂代謝、糖代謝、心血管疾病及腫瘤發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。
　　現(xiàn)已知 SIRT1可作用于胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Insulin/IGF-1)信號(hào)通路中的FOXO、IRS-1、PI3K/Akt及脂肪特異性基因PPARγ等,從而改善胰島素信號(hào)傳導(dǎo),參與糖脂代謝調(diào)控。那么SIRT1是否可以作用于 Insulin/IGF-1信號(hào)通路最上游基因——胰島素受體基因呢?是否可以調(diào)節(jié)胰島素受體蛋白

5、的數(shù)目及親和力,從而控制整個(gè)糖代謝通路呢?我們推斷,在SIRT1與脂肪細(xì)胞胰島素受體之間應(yīng)該存在著某種聯(lián)系,SIRT1很可能通過作用于脂肪細(xì)胞胰島素通路Insulin/IGF-1最上游胰島素受體基因,調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞表面胰島素受體蛋白的表達(dá),從而參與糖代謝的調(diào)控。
　　本實(shí)驗(yàn)將通過腺病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)分化后的3T3-L1細(xì)胞來研究SIRT1基因?qū)χ炯?xì)胞胰島素受體基因及蛋白表達(dá)的影響,從分子水平上研究糖尿病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,為進(jìn)一步探索胰島素

6、抵抗的機(jī)制及治療作了鋪墊。
　　材料與方法：
　　采用國(guó)際公認(rèn)的前脂肪細(xì)胞系3T3-L1為研究對(duì)象,在一定條件下將其誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞,油紅O染色鑒定。用Ad-mSirt1-IRES-eGFP腺病毒轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞,使其SIRT1基因高表達(dá),檢測(cè)INSR基因及蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分2組:(1)陰性對(duì)照組(2) Ad-mSirt1-IRES-eGFP腺病毒轉(zhuǎn)染組。收集兩組細(xì)胞,分別提取總RNA,定量PCR檢測(cè)INSR基因和SI

7、RT1基因的表達(dá)情況。并用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色、Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中胰島素受體及SIRT1蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組SIRT1蛋白及INSR蛋白表達(dá)均較對(duì)照組增加。
　　2、 Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組SIRT1蛋白及INSR蛋白表達(dá)均較對(duì)照組增加。
　　3、 Q-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組SIR

8、T1基因有明顯上調(diào);INSR明顯下調(diào)(可能由于Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確)。
　　結(jié)論：
　　上調(diào)由前脂肪細(xì)胞系3T3-L1分化成熟的脂肪細(xì)胞的SIRT1基因表達(dá)可影響其INSR的基因及蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組INSR基因mRNA水平下降,但蛋白水平升高。此處mRNA與蛋白表達(dá)水平不一致,可能因?qū)嶒?yàn)操作有誤導(dǎo)致Q-PCR結(jié)果不精確有關(guān);而WB結(jié)果通常較為可靠,且WB能顯示最終蛋白表達(dá)情況,也與本實(shí)驗(yàn)中免疫熒光