P2Y受體介導大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應及相關受體亞型mRNA和受體蛋白的表達.pdf

1、本實驗研究了P2受體介導大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應的藥理學特點，并應用實時熒光定量PCR技術絕對定量分析大鼠胃體平滑肌P2Y受體亞型mRNA的表達和免疫組織化學技術分析大鼠胃體平滑肌P2Y1與P2Y2受體的表達。
　　 第一部分核苷及核苷酸類物質介導大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應的藥理學特點制備大鼠離體胃體和胃底環(huán)行肌標本。利用受體藥理學技術觀察大鼠胃體和胃底環(huán)行肌不同的藥理學特征，并進一步分析核苷及核苷酸類物質誘發(fā)胃體環(huán)行肌收縮反應的作用

2、特點。
　　 1CCh、5-HT、His和KC1對大鼠胃體環(huán)行肌和胃底環(huán)行肌的作用在胃體環(huán)行肌KC1所致收縮反應與胃底環(huán)行肌無顯著性差別；但是，CCh收縮胃體環(huán)行肌的EC50值（0.45±0.15μmol·L-1）顯著高于胃底環(huán)行?。?.20±0.09μmol·L-1，P<0.01）。5-HT和His收縮兩種標本的EC50值無顯著差異（P>0.05）；但是，在胃體環(huán)行肌5-HT和His產生收縮反應的Emax值（0.81±0.26

3、和0.88±0.27g）顯著小于胃底環(huán)行?。?.67±0.61和1.90±0.68g，P<0.01）。
　　 2ATP對預收縮大鼠胃體環(huán)行肌和胃底環(huán)行肌的作用在預收縮胃體環(huán)行肌，ATP（0.1-3000μmol·L-1）誘發(fā)濃度依賴性收縮反應，未見舒張反應；在預收縮胃底環(huán)行肌標本，同濃度ATP誘發(fā)先舒張后收縮的雙相反應，并呈濃度依賴性。
　　 3核苷及核苷酸對大鼠胃體環(huán)行肌的作用。
　　 4酚妥拉明、普萘洛爾、阿

4、托品及河豚毒素對ATP和UTP誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應的影響。
　　 上述結果表明，大鼠胃體環(huán)行肌的藥理學特征明顯不同于胃底環(huán)行肌；核苷及核苷酸類物質誘發(fā)大鼠收縮反應的效價序列為2-MeSATP>>ADP>ATP=UTP>α，β-MeATP>>腺苷，提示通過P2Y受體介導胃體環(huán)行肌收縮反應；核苷酸類物質是調節(jié)胃體環(huán)行肌收縮功能的重要介質。
　　 第二部分P2Y受體介導大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應的受體藥理學分析本研究以2-M

5、eSATP和UTP分別脫敏相應的P2Y受體，觀察核苷酸類物質誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應的變化；同時分析了P2受體阻斷劑蘇拉明和PPADS對核苷酸類物質誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應的影響。
　　 1UTP和2-MeSATP脫敏P2Y受體對藥物誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應的影響ATP（30μmol·L-1）、UTP（3μmol·L-1）、ADP（3μmol·L-1）、2-MeSATP（0.03μmol·L-1）、α，β-MeATP（3μ

6、mol·L-1）、ACh（3μmol·L-1）、His（30μmol·L-1）和5-HT（3μmol·L-1）誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌的收縮反應在給予溶媒前后均無顯著性差異（P>0.05）。UTP（9μmol·L-1）脫敏時，ATP、ADP、2-MeSATP和5-HT誘發(fā)的大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應顯著增高（P<0.05），其中ATP組增加了41.1％，ADP組增加了46.7％，2-MeSATP組增加了38.6％，5-HT組增加61.3％；而α，

7、β-MeATP、ACh和His誘發(fā)的收縮反應無顯著性變化（P>0.05）。2-MeSATP（0.09μmol·L-1）脫敏時，ATP和ADP誘發(fā)的大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應明顯降低（P<0.01），其中ATP組降低了86.7％，ADP組的收縮反應完全抑制；UTP、α，β-MeATP、ACh、His和5-HT誘發(fā)的收縮反應無顯著性變化（P>0.05）。
　　 2蘇拉明和PPADS對ATP、UTP和2-MeSATP誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌收縮

8、反應的影響蘇拉明（100μmol·L-1）顯著抑制ATP（30μmol·L-1）、UTP（3μmol·L-1）和2-MeSATP（0.03μmol·L-1）誘發(fā)的大鼠胃體環(huán)行肌收縮反應（P<0.01）；其中ATP組降低了79.0％，UTP組降低了93.3％，2-MeSATP組降低了87.1％。PPADS（30μmol·L-1）使UTP（3μmol·L-1）誘發(fā)大鼠胃體環(huán)行肌的收縮反應降低61.6％（P<0.01），而對ATP（30μmo

9、l·L-1）和2-MeSATP（0.03μmol·L-1）誘發(fā)的收縮反應無明顯變化（P>0.05）。
　　 上述結果表明，大鼠胃體環(huán)行肌存在多種功能性P2Y受體亞型介導收縮反應；2-MeSATP、ATP和ADP可能激動環(huán)行肌細胞的同一P2Y受體亞型產生收縮反應，該收縮反應可被P2Y2和P2Y4受體脫敏所增強。P2Y2和P2Y4受體脫敏對5-HT誘發(fā)收縮反應的增強更為明顯。
　　 第三部分大鼠胃體平滑肌P2Y受體mRNA表

10、達的定量研究本研究應用RT-PCR技術分析了大鼠胃體平滑肌P2X受體亞型（P2X1-7）和P2Y受體亞型（P2Y1，2，4，6，11，12，13，14）mRNA的表達；并進一步應用實時熒光定量PCR技術，絕對定量分析P2Y1，2.4，6，12，13，14受體mRNA在大鼠胃體組織的表達水平。
　　 1RT-PCR法檢測P2X和P2Y受體亞型mRNA在大鼠胃體平滑肌的表達擴增產物使用2％瓊脂糖凝膠電泳分析。結果顯示陽性對照β-ac

11、tinmRNA擴增產物顯示與預期相同的特異性條帶；P2X1.2，4，5，7和P2Y1，2，4，6，12，13，14受體mRNA擴增產物在各自相應泳道出現(xiàn)與擴增目的片段大小相同的特異性條帶；P2X3，6和P2Y11受體mRNA擴增產物未出現(xiàn)擴增目的條帶。
　　 2實時熒光定量PCR法絕對定量分析大鼠胃體平滑肌P2Y受體mRNA的表達SYBR-green實時定量PCR檢測β-actinmRNA在大鼠胃體平滑肌的表達量為9，809，7

12、56.9拷貝數/10ng總RNA，顯著高于P2Y受體各亞型mRNA在大鼠胃體平滑肌的拷貝數（P<0.01）。各P2Y受體亞型mRNA在大鼠胃體環(huán)行肌表達強度順序為P2Y2>P2Y1>>P2Y12>P2Y6=P2Y14>P2Y13>P2Y4>P2Y11=0。P2Y2受體和P2Y1受體mRNA在大鼠胃體平滑肌的表達量分別為75，997.5±39，709.3和21，611.5±8，294.7（拷貝數/10ng，RNA），顯著高于其他P2Y受體

13、（P<0.01）。
　　 研究結果表明，除P2X3、P2X6和P2Y11受體亞型外，其他P2X和P2Y受體亞型的mRNA均表達于大鼠胃體平滑肌。大鼠胃體平滑肌P2Y受體亞型mRNA的絕對定量PCR分析結果表明，P2Y2受體和P2Y1受體mRNA是優(yōu)勢表達的P2Y受體，各受體亞型的表達強度順序為P2Y2>P2Y1>>P2Y12>P2Y6=P2Y14>P2Y13>P2Y4。
　　 第四部分P2Y1受體和P2Y2受體在大鼠胃體

14、平滑肌細胞的表達本研究應用免疫組織化學技術分析大鼠胃體平滑肌細胞（SMCs）P2Y1和P2Y2受體的表達，并對P2Y1和P2Y2受體在大鼠胃底與胃體的分布進行了比較。
　　 陰性對照組中，大鼠胃體和胃底全層標本無特異性著色。在大鼠胃體和胃底，粘膜固有層、粘膜肌、縱行肌、環(huán)行肌和肌間神經叢可檢測到P2Y1和P2Y2受體免疫反應陽性產物。腺體細胞和神經元的胞漿和平滑肌細胞的細胞核出現(xiàn)強陽性著色。
　　 大鼠胃體環(huán)行肌SMCs

15、的P2Y1受體和P2Y2受體的陽性細胞率分別為33.08％±9.93％和45.17％±6.11％，顯著高于縱行肌和粘膜肌SMCs的陽性細胞率（P<0.01）；大鼠胃底縱行肌、環(huán)行肌和粘膜肌SMCsP2Y1受體和P2Y2受體的表達與胃體相似。在大鼠胃體和胃底的縱行肌和環(huán)行肌層，P2Y2受體的陽性細胞率顯著高于P2Y1受體（P<0.05）；大鼠胃體粘膜肌SMCs的表達與此類似。大鼠胃體縱行肌、環(huán)行肌和粘膜肌SMCsP2Y2受體的陽性細胞率顯

16、著低于胃底同類SMCs的陽性細胞率（P<0.05）；胃體縱行肌和粘膜肌SMCs的P2Y1受體陽性細胞率顯著低于胃底同類SMCs的陽性細胞率（P<0.05），而在環(huán)行肌SMCs間無顯著性差別（P>0.05）。
　　 研究結果表明，在大鼠胃體和胃底組織，P2Y1受體和P2Y2受體表達于環(huán)行肌、縱行肌和粘膜肌SMCs的細胞核；兩種受體在環(huán)行肌的表達顯著高于縱行肌和粘膜肌。P2Y1受體和P2Y2受體在胃體縱行肌和粘膜肌的表達顯著低于胃底

17、。此外，在大鼠胃體、胃底環(huán)行肌和縱行肌SMCs，P2Y2受體的表達顯著高于P2Y1受體；胃體粘膜肌SMCs的P2Y2表達亦顯著高于P2Y1。
　　 核苷酸類物質使大鼠胃體環(huán)行肌產生濃度依賴性收縮反應，是調節(jié)胃體環(huán)行肌收縮活動的重要介質；大鼠胃體環(huán)行肌的藥理學特征明顯不同于胃底環(huán)行肌。
　　 大鼠胃體環(huán)行肌存在多種功能性P2Y受體亞型介導收縮反應。2-MeSATP、ATP和ADP可能作用于環(huán)行肌細胞的同一P2Y受體亞型產生

18、收縮反應，該收縮反應可被P2Y2和P2Y4受體脫敏所增強。
　　 P2Y受體家族中的P2Y1受體和P2Y2受體mRNA在大鼠胃體平滑肌組織呈優(yōu)勢表達，各受體亞型mRNA的表達強度順序為P2Y2>P2Y1>>P2Y12>P2Y6=P2Y14>P2Y13>P2Y4。
　　 大鼠胃體和胃底組織中P2Y1和P2Y2受體在環(huán)行肌層SMCs的表達顯著高于縱行肌層，兩種受體在胃體縱行肌層SMCs的表達顯著低于胃底。在大鼠胃體、胃底的環(huán)