CTB-LK在畢赤酵母和向日葵中的表達(dá)、檢測(cè)及其活性分析.pdf

1、血栓性疾病，尤其是心、腦血管血栓性疾病，已成為我國(guó)死亡率最高的疾病之一，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。蚓激酶(Lumbrokinase，LK)是從蚯蚓體內(nèi)提取的一種具有纖溶活性的蛋白水解酶，在臨床上對(duì)多種血栓疾病具有較好療效。然而LK的口服吸收利用度不高以及在胃腸道內(nèi)極易被降解，相對(duì)來(lái)說(shuō)限制了其在臨床上的應(yīng)用。而霍亂毒素B亞單位(cholera toxin B subunit，CTB)是由霍亂弧菌產(chǎn)生的無(wú)毒的受體結(jié)合亞單位，具有結(jié)合真核細(xì)胞上的神經(jīng)

2、節(jié)苷脂受體的功能，目前大量研究集中在將其與目的抗原偶聯(lián)或表達(dá)成融合蛋白后，使機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的抗特性抗原的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。本文我們利用CTB的作用特點(diǎn)來(lái)探索其在非抗原抗體藥物蛋白方面的是否具有較好的佐劑效果，以期利用CTB佐劑來(lái)提高LK的口服吸收利用率。
　　 在研究中我們構(gòu)建了LK表達(dá)載體pPIC9k-CTB-LK，并在CTB與LK之間引入了弗林蛋白酶水解位點(diǎn)，通過(guò)該位點(diǎn)的引入使CTB完成佐劑使命后被小腸上皮細(xì)胞中富含的弗林蛋

3、白酶切掉，使得其與LK分開(kāi)，同時(shí)在CTB下游添加(GGGGS)3 Linker序列，使得融合蛋白CTB-LK翻譯表達(dá)后可以得到正確折疊。CTB-LK在畢赤酵母中得到高效表達(dá)，經(jīng)過(guò)分離純化后，通過(guò)纖維蛋白平板法實(shí)驗(yàn)和小鼠血栓模型的構(gòu)建，說(shuō)明LK蛋白提取物和CTB-LK蛋白提取物都具有LK纖維活性和抑制小鼠血栓形成的功效，而且CTB可以發(fā)揮其增強(qiáng)LK口服吸收利用的效果。此外，本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到畢赤酵母表達(dá)CTB-LK后可以催化前體硅酸鈉形成

4、二氧化硅復(fù)合物，進(jìn)而對(duì)畢赤酵母進(jìn)行包埋，這種包埋方法簡(jiǎn)單易行，且能體現(xiàn)出傳統(tǒng)細(xì)胞包埋的特點(diǎn)。
　　 最后，我們使用含Marker Free植物表達(dá)載體pX6-CTB-LK的農(nóng)桿菌侵染向日葵子葉后得到轉(zhuǎn)基因向日葵植株，以向日葵基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，以及以向日葵基因組RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，說(shuō)明外源目的基因CTB-LK已經(jīng)成功整合到向日葵基因組中，并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，最終獲得轉(zhuǎn)基因種子兩顆。
　　 總之，本