人骨形態(tài)蛋白2在畢赤酵母中的表達(dá)和生物活性測(cè)定.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族成員中最有效的成骨信號(hào)分子之一，已被證明是刺激成骨和軟骨再生的較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)因子，并且其目前已用于多種骨折的治療，例如骨缺損，非結(jié)合性骨折，脊柱融合，骨質(zhì)疏松和根管手術(shù)等。然而直接從骨頭中分離BMPs具有成本高、產(chǎn)量低（1-3μg/kg）和純化方案復(fù)雜等問(wèn)題，而且不能很好地保持其生物活性。因此選擇基因重組的方式表達(dá)BMP2蛋白。為避免大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)在外源蛋白表達(dá)和純化過(guò)程中可能發(fā)生

2、的表達(dá)率低，包涵體形成，蛋白的不正確折疊和毒性等問(wèn)題，以巴斯德畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)作為替代方案，描述了通過(guò)體外分泌產(chǎn)生具有生物活性的rhBMPs。
　　本研究的主要目的是開(kāi)發(fā)一種高產(chǎn)量和簡(jiǎn)易的rhBMP2生產(chǎn)過(guò)程。首先對(duì)BMP2蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，選取編碼其前肽和成熟肽部分的基因作為表達(dá)的基因序列，并設(shè)計(jì)EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)、蛋白純化標(biāo)簽6×His，成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-BMP2與pPICZαA-BMP2，線性化表達(dá)

3、質(zhì)粒后分別轉(zhuǎn)進(jìn)GS115和X33菌株，并篩選高拷貝菌株誘導(dǎo)表達(dá);其次，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定分析，利用Ni2+-NTA柱純化rhBMP2蛋白，并對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇濃度、初始菌濃度、培養(yǎng)基pH等條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)Human BMP2ELISA Kit對(duì)rhBMP2進(jìn)行定量分析，確定最佳表達(dá)條件;最后，利用BMP2蛋白對(duì)小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)增殖分化的作用，測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性，MTT法測(cè)定細(xì)