HBsAg基因的克隆及其在畢赤酵母和葡萄組織中的表達(dá).pdf

1、本研究利用PCR擴(kuò)增出adr亞型乙肝表面抗原(HBsAg)基因，構(gòu)建了酵母和植物表達(dá)載體，通過巴斯德畢赤酵母和葡萄組織對(duì)獲得的乙肝表面抗原基因進(jìn)行表達(dá)研究，取得了如下進(jìn)展： 1.通過PCR將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pBI121/HB植物表達(dá)載體中的乙肝表面抗原基因擴(kuò)增出來，構(gòu)建了克隆載體pUC19HB，通過酶切對(duì)克隆載體進(jìn)行了鑒定和測(cè)序，并和NCBI中的基因序列進(jìn)行Blast，證實(shí)所獲得的基因序列和登陸號(hào)為AY646444.1的乙肝表面抗

2、原基因序列完全一致。結(jié)果表明，HBsAg基因已經(jīng)克隆至pUC19中。為HBsAg基因構(gòu)建表達(dá)載體奠定了基礎(chǔ)。 2.將克隆載體pUC19HB和酵母表達(dá)載體pPIC3.5K用相同的限制性內(nèi)切酶切割，回收目的片段，用T4DNA連接酶將兩者連接，篩選得到酵母表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定HBsAg基因已經(jīng)正確地連接到pPIC3.5K上。用LiCL法將重組以后的酵母表達(dá)載體導(dǎo)入甲醇型酵母(Pichia.pasteoris)菌株GS115中，獲得轉(zhuǎn)化

3、子。將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR篩選，得到酵母重組菌株。在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對(duì)重組酵母菌株進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)72小時(shí)后目的蛋白表達(dá)量最大，而且在23kDa和27kDa處均有目的條帶，說明Pichiapastoris成功表達(dá)了HBsAg蛋白，并進(jìn)行翻譯后加工修飾。對(duì)表達(dá)的蛋白用ELISA初步定性檢測(cè)結(jié)果為陽性，表明表達(dá)的HBsAg具有免疫活性，所獲得的HBsAg基因可以用于蛋白表達(dá)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下一步利

4、用該基因轉(zhuǎn)化植物材料提供有力的保證。 3.以植物表達(dá)載體pBI121/HB為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了新的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301/HB。將所構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌LBA4404，利用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)轉(zhuǎn)入葡萄愈傷組織中。 4.利用葡萄(VitisviniferaLinn.)作為表達(dá)HBsAg的受體材料。以葡萄葉片為誘導(dǎo)材料，在附加1mg/LNAA，0.1mg/L6-BANAA的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出葡萄愈傷組

5、織。pCAMBIA1301/HB載體中利用潮霉素抗性基因作為篩選基因，葡萄愈傷組織對(duì)不同濃度的潮霉素抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到30mg/L時(shí)就能完全有效的殺死組織細(xì)胞，而在20mg/L濃度下就可以比較好的抑制葡萄愈傷組織生長(zhǎng)，因此20mg/L被確定為葡萄愈傷組織篩選劑的基礎(chǔ)壓力。 5.在轉(zhuǎn)化前對(duì)葡萄愈傷組織進(jìn)行了預(yù)培養(yǎng)、甘露醇處理，結(jié)果表明葡萄愈傷組織預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3天左右轉(zhuǎn)化效率最高，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到50％。葡萄愈傷