蛋白激酶C活性變化對adipophilin介導脂質蓄積的影響.pdf

1、膽固醇等中性脂質的蓄積是動脈粥樣硬化泡沫細胞形成和四期病變發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。在真核細胞中,這些蓄積的脂質主要以脂滴的形式貯存于胞漿中。Adipophilin就是脂滴外周40余種相關蛋白中含量最高的一種。其功能主要是促進細胞中脂質的蓄積,抑制膽固醇的外流。在adipophilin基因啟動子區(qū)有過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR各亞型的反應元件PPRE,能夠與PPARγ1、PPARγ2結合并調控人adipophilin基因的表達。而參與多種脂

2、質代謝靶基因調控的核轉錄因子PPARs可以和轉錄共激活物PBP作用,直接接受信號轉導關鍵酶PKC的磷酸化調控。研究adipophilin在脂質蓄積中的調控因素尤其是具有良好藥物開發(fā)價值的PKC信號轉導通路,有可能為動脈粥樣硬化性疾病的防治帶來新的契機。本研究首先在動脈粥樣硬化新西蘭白兔模型上觀察Adipophilin和PKCα的表達;然后在細胞水平上觀察oxLDL對A10大鼠主動脈平滑肌細胞、THP-1人巨噬細胞和ECV304人臍靜脈內

3、皮細胞PKC活性和PPARγ與Adipophilin表達的影響;進一步應用PKC激動劑PMA和抑制劑CalphostinC觀察PKC活性的改變對荷脂THP-1巨噬細胞中PKCα、PPARγ和Adipophilin表達的影響,并檢測細胞內脂質蓄積的改變情況,以初步探討信號轉導途徑中的關鍵酶PKC調控adipophilin及脂質蓄積的可能機制。
　　第一部分動脈粥樣硬化新西蘭白兔Adipophilin和PKCα表達的變化
　　目

4、的：在動脈粥樣硬化新西蘭白兔動物模型上,觀察Adipophilin和PKCα表達的變化。
　　方法：采用本課題組建立的新西蘭兔動脈粥樣硬化動物模型。24只新西蘭白兔,隨機分為對照組和實驗組。用高膽固醇飲食飼喂新西蘭白兔12w,動脈切片HE染色;采用Westernblot蛋白印跡和免疫組化染色檢測Adipophilin和PKCα表達。
　　結果：喂養(yǎng)12周后頸總動脈放血處死動物,實驗組新西蘭白兔病變主動脈區(qū)可見內膜增生、中膜增

5、厚,脂質條紋突起,增生內膜內蓄積有大量的泡沫細胞。實驗組主動脈病變區(qū)adipophilin和PKCα表達上調,與adipophilin陽性顆粒僅局限于增生內膜不同,PKCα在內膜、近內膜的中膜區(qū)均呈強陽性表達。
　　結論：動脈粥樣硬化新西蘭白兔主動脈明顯增厚,病變區(qū) Adipophilin, PKCα表達上調。
　　第二部分 OxLDL對A10、THP-1及ECV304三種細胞PKC活性和巨噬細胞PPARγ與Adipophi

6、lin表達的影響
　　目的：以A10、THP-1及ECV304三種細胞為研究對象,觀察氧化型低密度脂蛋白對三種細胞PKC活性和PPARγ與Adipophilin表達的影響。
　　方法：用0,10,20,40,80μg/ml oxLDL共孵育24h,PepTag?非放射性蛋白激酶檢測法對荷脂細胞胞膜中 PKC活性進行定性定量檢測---瓊脂糖凝膠電泳分離磷酸化條帶,觀察活性變化的趨勢,紫外/可見分光光度計檢測570nm吸光度,定

7、量酶的絕對活性;半定量RT-PCR和Westernblot檢測adipophilin、PPARγ和α亞型PKC表達的變化情況;油紅O染色觀察細胞內脂質蓄積情況。
　　結果：隨著 oxLDL濃度的增加,A10細胞膜 PKC活性從靜息狀態(tài)的0.2613±0.0521units/ml陡增至0.7685±0.0869units/ml;THP-1巨噬細胞由0.0670±0.0091units/ml增至0.1357±0.0235units/m

8、l;ECV304內皮細胞由0.0550±0.0075units/ml增至0.1216±0.0187units/ml,其中平滑肌細胞膜活性增幅最大。RT-PCR和Westernblot檢測顯示平滑肌細胞和內皮細胞不表達adipophilin;隨著氧化低密度脂蛋白濃度的增加,THP-1巨噬細胞adipophilin、PPARγ和α亞型PKC表達明顯增強。油紅O染色顯示細胞內脂滴增加,部分融合成大脂滴。
　　結論：oxLDL濃度依賴性的

9、增強平滑肌細胞、巨噬細胞和內皮細胞的蛋白激酶 PKC活性;adipophilin只表達于THP-1巨噬細胞;oxLDL明顯的上調PKCα、PPARγ和Adipophilin的表達,其中,oxLDL對PKCα的作用最顯著;oxLDL可以促進THP-1巨噬細胞中脂滴的蓄積。
　　第三部分蛋白激酶C在adipophilin促THP-1巨噬細胞脂質蓄積中的作用研究
　　目的：以THP-1巨噬細胞為研究對象,觀察PKC激動劑PMA和抑

10、制劑Calphostin C對胞膜PKC活性、胞膜PKCα及胞漿內PPARγ和adipophilin表達以及細胞內脂質蓄積的影響,初步探討PKC調控adipophilin表達和脂質蓄積的作用機制。
　　方法：實驗分兩個部分:第一部分分組,10μl DMSO溶媒對照組;50μg/ml oxLDL+10μl DMSO組;50μg/ml oxLDL+100nmol/l PMA組;50μg/ml oxLDL+300nmol/lCalpho

11、stin C組,各組均在含2g/L BSA無血清培養(yǎng)基中與THP-1巨噬細胞共孵育16h;第二部分分組,50μg/ml oxLDL+10μl DMSO組;50μg/ml oxLDL+25nmol/lCalphostin C組;50μg/ml oxLDL+50nmol/lCalphostin C組;50μg/mloxLDL+100nmol/lCalphostinC組;50μg/ml oxLDL+200 nmol/l CalphostinC

12、組;50μg/ml oxLDL+400nmol/lCalphostin C組均在含2g/L BSA無血清培養(yǎng)基中與 THP-1巨噬細胞共孵育細胞16h。檢測方法及指標同第二部分。
　　結果：100nmol/l PMA在激活胞膜 PKC(0.2514±0.0154units/ml)的同時可以與oxLDL協(xié)同增強PKCα、PPARγ和Adipophilin表達并使細胞內脂滴的蓄積極大的增強,細胞內膽固醇酯/總膽固醇比值增至69.8±9

13、.5％;300nmol/lCalphostin C對荷脂THP-1巨噬細胞的處理則抑制酶活性至0.0927±0.0056units/ml,細胞內脂滴減少,膽固醇酯/總膽固醇比值降至40.1±9.1%;Calphostin C呈劑量依賴性的方式下調酶活性、PKCα、PPARγ和Adipophilin表達,400nmol/lCalphostin C基本上可以逆轉50μg/ml oxLDL誘導的酶活化和PKCα、PPARγ和Adipophil

14、in表達的上調。
　　結論：佛波酯PMA增加荷脂THP-1巨噬細胞的蛋白激酶C活性,與oxLDL協(xié)同增強adipophilin、PPARγ和PKCα的表達,并進一步促進脂滴的蓄積和提升膽固醇酯/總膽固醇比值;抑制劑Calphostin C降低荷脂巨噬細胞胞膜PKC活性,減少細胞內脂質的蓄積,并呈劑量依賴性的下調Adipophilin、PPARγ和PKCα的表達。
　　總結：①動脈粥樣硬化新西蘭白兔主動脈病變區(qū)Adipophi

15、lin, PKCα表達上調。
　?、趏xLDL濃度依賴性的增強平滑肌細胞、巨噬細胞和內皮細胞的蛋白激酶PKC活性;adipophilin只表達于THP-1巨噬細胞;oxLDL明顯的上調PKCα、PPARγ和Adipophilin的表達,其中,oxLDL對PKCα的作用最顯著;oxLDL可以促進THP-1巨噬細胞中脂質蓄積。
　?、鄯鸩MA增加荷脂THP-1巨噬細胞的蛋白激酶C活性,與oxLDL協(xié)同增強adipophili