淡色庫蚊對有機磷和氨基甲酸酯抗性相關基因的研究.pdf

1、淡色庫蚊(Culexpipienspallens)是我國北方廣泛分布的重要病媒蚊蟲，是城市滅蚊的主要對象之一。由于其主要孳生于污水溝中，長期接觸農用、林用和衛(wèi)生用有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑，已漸漸對這兩類殺蟲劑產生了抗性。在環(huán)境受到污染的同時，蚊蟲抗性的產生也大大加大了對其防治的難度，因此迫切需要對殺蟲劑抗性的發(fā)生和發(fā)展進行深入研究。本項研究主要針對淡色庫蚊敏感株和野外株對有機磷和氨基甲酸酯抗性相關基因進行研究，試圖了解淡色庫蚊抗性相關

2、代謝酶基因和靶標酶基因與抗性水平之間的關系，探討抗性相關基因的變化在淡色庫蚊抗性形成中的作用，從分子水平對抗性相關基因(羧酸酯酶基因和乙酰膽堿酯酶基因)進行研究，為更進一步深入地研究淡色庫蚊的抗性機理打下理論基礎。 本研究的主要結果如下：1.淡色庫蚊野外株對殺蟲劑抗性水平檢測結果采用殘殺威、敵敵畏和辛硫磷三種殺蟲劑對實驗室敏感株和北京市郊8個野外株淡色庫蚊進行生物學檢測。結果顯示淡色庫蚊野外株對不同殺蟲劑均有不同程度的抗性：對殘

3、殺威抗性指數從3.13至7.24倍，對敵敵畏抗性指數從2.84至9.88倍，對辛硫磷抗性指數從1.15至3.33倍。 2.淡色庫蚊篩選抗性株的抗性機制使用殘殺威對淡色庫蚊野外株進行篩選，篩選8代后抗性指數由原來的4.79倍上升至12.07倍。對敏感株和篩選抗性株分別進行羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性測定，結果顯示羧酸酯酶在對殘殺威的抗性形成中作用較小，而乙酰膽堿酯酶的敏感性降低與篩選抗性株的抗性形成有關。 3.淡色庫蚊野外株

4、酯酶基因表達量的分析及與對殺蟲劑抗性的相關性對淡色庫蚊11個野外株的Estα2-Estβ2基因進行定量分析，結果顯示，軍事醫(yī)學科學院博士學位論文-2-Estα2基因在mRNA中的拷貝數相差比較大，而Estβ2基因在mRNA中的拷貝數相差則要小一些。兩個基因的拷貝數之間存在著顯著的正相關關系，而表達量卻有一定的差別，所有10個淡色庫蚊野外株Estα2與Estβ2基因拷貝數的比值平均為1：18.7。另外，結果顯示Estα2基因的拷貝數與對敵

5、敵畏的抗性之間存在著顯著的正相關關系，說明淡色庫蚊體內Estα2基因的擴增與敵敵畏給予的選擇壓力有關。 4.淡色庫蚊的ACHE1在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達將淡色庫蚊的Ace1基因ORF序列導入載體在Sf9細胞中表達，SDS-PAGE電泳和酶活性測定均顯示已成功的進行了表達。以碘化硫代乙酰膽堿為底物，檢測重組表達ACHE1的生物學活性，結果顯示細胞內和上清中的重組表達酶均具有生物學活性，細胞內酶蛋白的活性比上清中高。

6、5.淡色庫蚊Ace1基因的可變剪接及對ACHE1酶活性的影響在淡色庫蚊的Ace1基因上發(fā)現了一個可變剪接，實驗室敏感株的兩個個體Ace1基因的編碼區(qū)相差了24個堿基，導致所編碼的成熟蛋白在44～51氨基酸殘基處缺失了8個氨基酸。經過在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達，證實這段基因的可變剪接對AChE的活性有一定的影響。 6.淡色庫蚊Ace1基因的突變及其可能的生物學意義在淡色庫蚊的喇叭溝門野外株中，在Ace1基因ORF上發(fā)現了單堿基

7、突變，導致其編碼的氨基酸由丙氨酸突變成了絲氨酸，該點突變發(fā)生在存在于所有物種AChE的保守序列(FGESAG)上，位于AChE活性位點溝的底部，是氧陰離子洞的組成部分。推測與當地淡色庫蚊對某種氨基甲酸酯或有機磷殺蟲劑的抗性有關。7.突變基因在淡色庫蚊野外株中的頻率及可能的生物學意義 應用PCR-限制性內切酶法對喇叭溝門株的Ace1基因進行突變點檢測，結果顯示，在2003年喇叭溝門的蚊蟲株中，突變率為19.23％；而在2004年，