家蠶和野桑蠶對有機(jī)磷農(nóng)藥抗性的研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)和野桑蠶(Bombyx mandarina)具有共同的起源，家蠶的人工馴化歷史已經(jīng)有5700多年，經(jīng)過長期的人工選擇，家蠶的產(chǎn)絲性能得到了大幅度的提高，但對環(huán)境的適應(yīng)性出現(xiàn)了退化的趨勢；野桑蠶長期棲息在野外的桑樹上，經(jīng)過自然選擇和農(nóng)藥的壓力選擇，其對野外環(huán)境的抗性，特別是對農(nóng)藥的抗性表現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢。一方面，家蠶由于對農(nóng)藥的抗性弱，每年都造成大量的農(nóng)藥中毒現(xiàn)象，有的蠶區(qū)已經(jīng)放棄秋蠶的飼養(yǎng)；另一方面，野桑蠶由于

2、對農(nóng)藥的抗性在增強(qiáng)，嚴(yán)重危害桑葉的生產(chǎn)，成為制約蠶絲業(yè)健康發(fā)展的一對矛盾。為了比較研究家蠶和野桑蠶對有機(jī)磷農(nóng)藥抗性差異的分子基礎(chǔ)，本文以家蠶品種大造和蘇州系統(tǒng)的野桑蠶為研究材料，比較研究了家蠶和野桑蠶對辛硫磷農(nóng)藥的敏感性、乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性、兩種類型乙酰膽堿酯酶基因(ace)的結(jié)構(gòu)、ace在農(nóng)藥誘導(dǎo)下的表達(dá)特征及家蠶和野桑蠶的ace2的體外表達(dá)產(chǎn)物對毒扁豆堿的敏感性。 以家蠶和野桑蠶的各齡起蠶為實(shí)驗(yàn)材料，采用浸葉法，

3、研究了1～5齡家蠶和野桑蠶對辛硫磷農(nóng)藥的抗性的差異。結(jié)果表明，小蠶期家蠶和野桑蠶對辛硫磷的敏感性差異相對較小，隨著齡期的增大，家蠶和野桑蠶對辛硫磷農(nóng)藥的敏感性差異較大，野桑蠶4齡LC50為家蠶的4．43倍，5齡為家蠶的4．02倍。 為了研究家蠶和野桑蠶的AChE的活性及毒扁豆堿對其抑制中量(I50)差異，本文以家蠶和野桑蠶2齡起蠶及5齡第3 d的頭、中腸、脂肪體和絲腺為實(shí)驗(yàn)材料，測定了AChE的酶活性和I50。結(jié)果表明，野桑蠶2

4、齡起蠶的酶活是家蠶的1．65倍；5齡第3 d野桑蠶和家蠶的頭、中腸、脂肪體和絲腺的酶活之比分別為：1．90倍、2．23倍、2．76倍、2．78倍；毒扁豆堿對家蠶和野桑蠶AChE的I50分別為5．02×10-7M和5．23×10-7M。 構(gòu)建了野桑蠶腦組織的cDNA文庫，經(jīng)鑒定文庫的滴度達(dá)3．5×105 pfu/mL，文庫插入片段的平均大小為1．2 kb。從文庫的測序結(jié)果中獲得野桑蠶化學(xué)感受蛋白基因(CSP3)完整的開放閱讀框(登

5、錄號：EU439267)并對其進(jìn)行了序列分析。結(jié)果表明：該基因讀碼框由384個(gè)核苷酸組成，編碼127個(gè)氨基酸，分子量為14．6 kD。通過對該基因編碼的氨基酸和其它17種昆蟲的CSP編碼的氨基酸進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該基因與家蠶的CSP3的同源性最高，達(dá)96．85％。該基因的發(fā)現(xiàn)對于研究家蠶和野桑蠶對化學(xué)農(nóng)藥的敏感性具有重要意義。 利用RT-PCR方法，克隆了家蠶乙酰膽堿酯酶基因(Bm-ace1、Bm-ace2)。序列分析表明：Bm

6、-acel的ORF包含堿基2025 bp，編碼683個(gè)氨基酸，推導(dǎo)其表達(dá)蛋白的分子量為76．955 kD，等電點(diǎn)(pI)為6．36；Bm-ace2的ORF包含堿基1917 bp，編碼638個(gè)氨基酸，推導(dǎo)其表達(dá)蛋白的分子量為71．675 kD，等電點(diǎn)(pI)為5．49；Bm-ace1和Bm-ace2均具有乙酰膽堿酯酶基因(ace)的特征性區(qū)域。進(jìn)化分析表明：Bm-ace1(ABY50088)和來源于中國野桑蠶的Bmm-ace1(ABM66

7、370)的同源性最高，達(dá)99．71％，Bm-ace2(ABY50089)和來源于中國家蠶的Bm-ace2(NP001037366)的同源關(guān)系最近，為99．84％。依據(jù)家蠶基因組信息，將Bm-acel和Bm-ace2分別定位于第15號和第9號染色體，為深入研究家蠶對有機(jī)磷農(nóng)藥的抗性機(jī)制打下基礎(chǔ)。 為了進(jìn)一步研究野桑蠶和家蠶對辛硫磷農(nóng)藥的抗性差異的分子基礎(chǔ)，采用了RT-PCR、RACE方法，克隆了野桑蠶兩種AChE基因的cDNA全長

8、，命名為Bmm-ace1和Bmm-ace2，對其進(jìn)行了序列分析。研究結(jié)果表明：Bmm-ace1和家蠶ace1(Bm-ace1)編碼的氨基酸數(shù)均為681，同源性達(dá)99．71％，存在2個(gè)氨基酸的突變(G664S、S307P)，野桑蠶ace2(Brain-ace2)和家蠶ace2(Bin-ace2)編碼的氨基酸數(shù)為634，同源性達(dá)99．37％，存在4個(gè)氨基酸的突變(M18I、N233S、I310V、G621S)。進(jìn)化分析表明，ace2在物種之

9、間相對保守。分析Bmm-ace1的cDNA5'翻譯序列(5UTR)區(qū)域，與家蠶ace1基因(Bm-ace1)的cDNA5'UTR(242個(gè)堿基)相比，Bmm-acel的5'UTR包含有231個(gè)堿基，存在2個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變和一段連續(xù)11個(gè)堿基的缺失。通過克隆和測序分析野桑蠶基因組中Bmm-ace1的5'UTR片段，表明野桑蠶和家蠶ace1基因的RNA剪切都遵循GT-AG規(guī)則，但在其cDNA5'UTR的RNA剪接過程中存在差異，野桑蠶在其cD

10、NA上游+33處存在比家蠶少剪接的序列TGATTTGAAGG，而在其基因組中5'UTR的TGATTTGAAGG序列下游一4位點(diǎn)缺失ACAGA序列。研究結(jié)果可為深入探討ace1基因和抗藥性的關(guān)系提供新的信息。 為了比較研究家蠶和野桑蠶ace1和ace2基因在幼蟲各發(fā)育階段、各組織及其在辛硫磷農(nóng)藥誘導(dǎo)后的表達(dá)特征。本實(shí)驗(yàn)采用了半定量RT-PCR方法，研究了ace1、ace2在野桑蠶和家蠶的1～5齡各發(fā)育階段、5齡第3 d的血淋巴、腦

11、組織、中腸、脂肪體和絲腺各組織的表達(dá)特點(diǎn)；并且研究了在不同濃度的辛硫磷添食后的表達(dá)特征，并研究了高于致死中量濃度的辛硫磷誘導(dǎo)后，ace1和ace2在各組織的表達(dá)特點(diǎn)。發(fā)育表達(dá)分析表明，從1齡到5齡家蠶Bm-ace1和Bm-ace2的表達(dá)量都表現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其中Bm-ace1的最低表達(dá)量在3齡、Bm-ace2的最低表達(dá)量在2齡，野桑蠶從1齡到5齡Bmm-ace1和Bmm-ace2的表達(dá)量都表現(xiàn)逐步下降的趨勢，其中Bmm-ace1的

12、下降趨勢較Bmm-ace2明顯，和家蠶呈現(xiàn)不同的表達(dá)特征。組織表達(dá)分析表明，ace1只在家蠶和野桑蠶的腦組織和脂肪體中表達(dá)，ace2在家蠶和野桑蠶的所研究的組織中都有表達(dá)，ace1和ace2在腦組織和脂肪體內(nèi)過量表達(dá)；ace1在家蠶和野桑蠶的腦組織表達(dá)量一致，而ace2在野桑蠶的腦組織表達(dá)量為家蠶的4．17倍。辛硫磷添食后的表達(dá)表明，2齡家蠶和野桑蠶在小于致死中量濃度時(shí)，隨著濃度的上升，ace1的表達(dá)量都在增加，ace2在家蠶體內(nèi)有增加

13、的趨勢，但在野桑蠶體內(nèi)維持較高的表達(dá)量，總體表達(dá)量在不斷下降；在高于致死中量的辛硫磷誘導(dǎo)下，ace1和ace2的表達(dá)量都在減少，但Bmm-ace2的減少量較少。高于致死中量的辛硫磷誘導(dǎo)后的組織表達(dá)分析表明，在脂肪體的表達(dá)量都存在減少的趨勢，Bmm-ace1、Bm-ace1、Bm-ace2分別減少了82．67％、81．11％、84．50％，Bmm-ace2的表達(dá)減少程度較低，只有30．56％。 為了比較研究Bm-ace2和Bmm-

14、ace2基因的表達(dá)產(chǎn)物的生物活性及其對農(nóng)藥代謝的差異，分別將Bm-ace2和Bmm-ace2克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTB中獲得pFast-Bm-ace2和pFast-Bmm-ace2，分別將其轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞后，用PCR方法檢測證實(shí)所分離的重組病毒DNA中含有目的片段的基因。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，分別獲得重組病毒。SDS-PAGE和Western Blot分析表明，Bm-ace2和Bmm-ace2均被