東亞飛蝗有機磷抗性相關(guān)羧酸酯酶基因的特性及功能研究.pdf

1、羧酸酯酶是昆蟲體內(nèi)重要的代謝解毒酶系，其主要功能是水解內(nèi)源性和外源性含有酯鍵的有毒物質(zhì)，減緩其到達靶標(biāo)部位的時間。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，羧酸酯酶參與昆蟲抗藥性的產(chǎn)生。東亞飛蝗是重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲，由于長期使用化學(xué)農(nóng)藥治理蝗災(zāi)，使得田間東亞飛蝗種群對殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。2004年馬恩波等首次發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗對有機磷農(nóng)藥產(chǎn)生抗性，楊美玲等通過生物測定和生化實驗證實了東亞飛蝗黃驊田間種群對馬拉硫磷的抗藥性與酯酶活性增加相關(guān)。
　　為進

2、一步深入探討東亞飛蝗羧酸酯酶介導(dǎo)的有機磷抗性分子機制，本文基于東亞飛蝗EST數(shù)據(jù)庫平臺，通過生物信息學(xué)方法獲得東亞飛蝗25個羧酸酯酶ESTs，采用Real-time PCR技術(shù)篩選出12個與抗性相關(guān)的羧酸酯酶基因，分析了其在不同組織部位（前腸、中腸、后腸、胃盲囊、馬氏管、脂肪體、表皮和頭部）的表達差異，結(jié)果顯示:所有基因在東亞飛蝗胃盲囊處表達，且有6個基因在胃盲囊處特異性表達?？剐苑N群(Field Resistant Populatio

3、n，F(xiàn)R)中的表達量較敏感品系(LaboratorySusceptible Strain，LS)為高。與LS相比，在FR中表達量差異最大的基因LmCarE20僅在東亞飛蝗的頭部表達，其抗性倍數(shù)高達11.6倍，RT-PCR電泳結(jié)果顯示，LmCarE20在FR種群的表達量明顯高于LS品系。
　　本文對所獲得的12個抗性相關(guān)羧酸酯酶基因在敏感品系不同發(fā)育階段的表達情況進行了研究，結(jié)果顯示:在東亞飛蝗6個發(fā)育階段（1-5齡若蟲和成蟲）中，

4、各基因無論在整頭蟲還是在中腸（包含胃盲囊）中的表達均沒有顯著差異。
　　本文采用RACE-PCR技術(shù)共獲得東亞飛蝗2個羧酸酯酶基因全長序列。Oakeshott等對果蠅、岡比亞按蚊和其它33種昆蟲的共132條羧酸酯酶/膽堿酯酶基因構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得A-N共14個進化分支，發(fā)現(xiàn)對殺蟲劑起解毒代謝功能的羧酸酯酶基因均聚在A、B和C三個分支。根據(jù)Oakeshott等的研究結(jié)果，本文將RACE擴增獲得的2個基因與其它5個昆蟲物種的31條

5、羧酸酯酶基因（這31條基因分屬于羧酸酯酶基因的A、H和N簇）進行N-J聚類分析，結(jié)果顯示:LmCarE9和LmCarE25均聚于A簇，推測這2個羧酸酯酶基因與東亞飛蝗代謝解毒相關(guān)，將其分別命名為Lm CarEA1和LmCarEA2。
　　本文近一步研究了獲得全長的2個羧酸酯酶基因LmCarE9和LmCarE25在東亞飛蝗有機磷抗藥性的功能。采用體外注射技術(shù)將體外獲得的dsRNA注入到2齡東亞飛蝗二三腹節(jié)之間，檢測其基因表達情況，β

6、-actin為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示:注射目的基因dsRNA后，12小時兩基因表達有所下調(diào)，24小時兩基因干擾效果顯著且存在相互干擾現(xiàn)象，72小時和96小時兩基因表達上調(diào)到原始水平。目的基因沉默(RNAi)后采用Duncan多重檢驗分析東亞飛蝗對馬拉硫磷的敏感性，結(jié)果顯示:與對照組相比，分別注射LmCarE9、LmCarE25和2基因混合液dsRNA的蟲體對馬拉硫磷的敏感性顯著提高。
　　綜上所述，本文研究結(jié)果為東亞飛蝗羧酸酯酶基因抗