嬰幼兒血管瘤病程相關microRNAs的篩選和作用研究.pdf

1、嬰幼兒血管瘤(Infantile hemangiomas,IH)是嬰幼兒最常見的軟組織腫瘤,高加索人種發(fā)病率在4-12％之間,亞洲人種發(fā)病率在1％左右,女嬰相對高發(fā),男女比例為1:3-4,早產低體重兒發(fā)病率明顯升高。嬰幼兒血管瘤一般在出生后數(shù)天或數(shù)周內即進入增生期表現(xiàn)為瘤體快速增殖,持續(xù)數(shù)周或數(shù)月后轉入平臺期,隨后進入數(shù)年緩慢自發(fā)性的消退期,這種自然病程是IH的重要特征。雖然多數(shù)患兒的瘤體能夠消退完全,但多留有疤痕或脂肪沉積樣改變,增生

2、早期對瘤體的控制能夠減少殘留面積,同時約60％的IH瘤體發(fā)生于具有重要美學和生理功能的面頸部,以及仍有約20％的嬰幼兒血管瘤因其顯著的生長性,或者侵犯、影響正常生理功能甚至威脅嬰幼兒生命而需要臨床及時治療,因尚無法預判患兒瘤體發(fā)展是否存在風險并需要特殊治療,故IH的早期干預治療越來越受到重視。但IH的具體發(fā)病機制仍然不明,臨床治療帶有一定的盲目性,因此IH的機制研究成為必要。目前的研究傾向于IH來源于嬰幼兒血管瘤干細胞,具有未分化性表面

3、標記物的不成熟血管內皮細胞的大量增殖,是嬰幼兒血管瘤增殖期快速生長的關鍵原因。多項研究表明VEGFR2信號通路的高活性狀態(tài)對IH增生期的血管內皮細胞的增殖和遷移中起到了關鍵的作用,而NF-kB信號通路,Notch信號通路對IH的影響與VEGF信號通路活性的增強有密切的聯(lián)系,臨床廣泛使用的糖皮質激素和普萘洛兒治療IH的機制研究也與VEGF信號通路活性密切相關。IH臨床表現(xiàn)為增生期、平臺期和消退期,機制研究發(fā)現(xiàn)平臺期是一種過度狀態(tài),是IH瘤

4、體主要增殖細胞血管內皮細胞逐漸停止增殖,并逐漸消失伴隨脂肪和纖維組織沉積的過度狀態(tài)。關于IH消退的多項研究發(fā)現(xiàn)凋亡在其中具有重要作用,同時干細胞向脂肪細胞的分化和沉積可能也是消退的重要原因。但作為轉錄后調節(jié)的重要調節(jié)因子microRNA在IH中的研究尚未見文獻報道。因此本課題旨在從microRNA在嬰幼兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用出發(fā),對IH的病程發(fā)展機制進行了進一步的研究,為更有效的指導臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 本課題主要研究

5、了以下內容:
　　 第一部分:不同時期嬰幼兒血管瘤組織差異microRNA的芯片檢測和篩選
　　 實驗方法本研究在抽提獲得臨床收集的臨床確診IH標本總RNA基礎上,通過Affymetrix miRNA3.0芯片對典型增生早期,平臺期和消退期3例IH標本的microRNA進行檢測,并通過miRanda數(shù)據(jù)庫和Targetscan數(shù)據(jù)庫分析預測靶基因,在取兩者交集作為靶基因后,對基因進行功能分析,篩選和IH相關功能基因構建m

6、icroRNA與靶基因的調控網(wǎng)絡。對獲取的不同時期IH組織標本共9例,增生早期4例,平臺期3例,消退期2例,抽提總RNA后進行反轉錄,設計hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-130b-3p, hsa-miR-206, hsa-miR-371 a-5p, hsa-miR-373-3p, hsa-miR-455-5p莖環(huán)狀引物,采用SuperReal PreMix(SYBRGreen)試劑進行reaitimePCR實時定量檢測。實

7、驗所得數(shù)據(jù)以2-△△CT進行量化分析。
　　 實驗結果三例標本芯片檢測結果進行兩兩比較,差異倍數(shù)以3倍及以上作為差異microRNA入選標準,共獲得差異microRNA有38個,依疾病進程下調的microRNA共22個,上調microRNA共16個。獲得這些差異microRNA的預測靶基因共2463個,基因功能GO-Analysis后,以IH疾病可能相關功能篩選得靶基因共540個,以此構建的microRNA與基因的調控網(wǎng)絡顯示處

8、于調控網(wǎng)絡中心的microRNA為: hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-130b-3p, hsa-miR-206, hsa-miR-371a-5p,hsa-miR-373-3p,hsa-miR-455-5p。9例標本抽提總RNA質檢合格,各microRNA引物設計符合要求,realtimePCR結果顯示,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-206,hsa-miR-455-5p組間存在統(tǒng)計學差異,hsa-miR-1

9、30b-3p,hsa-miR-371a-5p,hsa-miR-373-3p組間無統(tǒng)計學差異。
　　 第二部分:嬰幼兒血管瘤來源血管內皮細胞的培養(yǎng)和鑒定
　　 實驗方法:獲取經(jīng)確診的IH增生早期手術后標本,消毒處理后第一時間于4℃條件下以分散酶作用24h,去除表皮碎化組織后以膠原酶于37℃下作用40min,隨后進行細胞過濾,過濾后單細胞懸液以CD31偶聯(lián)磁珠結合后經(jīng)磁珠分選儀分選。分選后細胞以人臍靜脈內皮細胞為對照,進行細

10、胞生長曲線測定,細胞吞脂實驗、血管內皮細胞成管實驗、CD31和vWF抗體進行細胞免疫熒光染色實驗進行細胞鑒定。
　　 實驗結果:IH血管內皮細胞分選條件良好,可獲得較充分的細胞量,分選后細胞生長狀態(tài)良好,增殖能力自培養(yǎng)第三天后較人臍靜脈內皮細胞增長更快;細胞吞脂實驗顯示與人臍靜脈內皮細胞無明顯差異;成管實驗顯示與人臍靜脈內皮細胞比較,IH來源血管內皮細胞具備更快的成管能力,但成管較為雜亂;細胞免疫熒光染色顯示IH來源血管內皮細胞

11、CD31和vWF抗體陽性,所培養(yǎng)細胞陽性率在92±3％。
　　 第三部分:hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-206,hsa-miR-455-5p對嬰幼兒血管瘤來源內皮細胞的作用研究
　　 實驗方法:以fam熒光標記miR-67為轉染對照,單純轉染試劑為陰性對照,通過轉染試劑將hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-206,hsa-miR-455-5p的mimics或inhibitor轉染入IH來源血管內

12、皮細胞,通過cck-8法檢測細胞活性反映細胞增殖能力改變,流式細胞儀檢測細胞凋亡水平改變,transwell侵襲系統(tǒng)檢測細胞侵襲能力改變,研究轉染前后目的microRNA對IH來源內皮細胞增殖、凋亡與侵襲能力的影響。
　　 實驗結果:fam熒光標記miR-67顯示轉染條件良好,轉染效率近100％;和對照組比較,細胞轉染hsa-miR-29a-3p的mimics后48h增殖能力無明顯改變,轉染后48h出現(xiàn)明顯細胞凋亡,轉染24h后

13、侵襲能力無明顯改變,細胞轉染hsa-miR-29a-3p的inhibitor后48h細胞增殖凋亡與侵襲能力無明顯改變;和對照組比較,細胞轉染hsa-miR-206的mimics后48h增殖能力明顯減弱,轉染后48h出現(xiàn)明顯細胞凋亡,轉染24h后侵襲能力明顯減弱,細胞轉染hsa-miR-206的inhibitor后增殖與細胞凋亡無明顯改變,細胞侵襲能力明顯增強;和對照組比較,細胞轉染hsa-miR-455-5p的mimics和inhibi

14、tor后48h增殖能力無明顯改變,轉染后48h無明顯細胞凋亡,轉染24h后侵襲能力無明顯改變。
　　 本課題研究結論miR-29a-3p,miR-206,miR-455-5p在IH不同時期的nicroRNA表達譜中存在差異,這些差異miRNA可能參與了IH病程進展多種相關功能調節(jié);miR-29a-3p可能通過改變IH血管內皮細胞的凋亡水平影響疾病進程,特別是對IH的自發(fā)消退起到了重要的轉錄后調節(jié)作用;miR-206可能通過改變I