Fas配體誘導(dǎo)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實驗研究.pdf

1、血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤,文獻(xiàn)統(tǒng)計約有4％～12％白種新生兒出現(xiàn)血管瘤,男女發(fā)病比例為1:3～5,早產(chǎn)低體重兒發(fā)病率更高,可高達(dá)23％,血管瘤好發(fā)頭面頸部(60％),其次為四肢(25％)和軀干(15％)。目前血管瘤發(fā)病機(jī)制仍不清楚,研究顯示血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell NuclearAntigen,PCNA)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(Glucose Transporter-1,GLUT-1)以

2、及淋巴內(nèi)皮生長因子(Lymphatic Endothelial Hyaluronan Receptor-1,LYVE-1)等,并表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志CD133,提示血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞可能處于細(xì)胞發(fā)育的幼稚階段,是不成熟的內(nèi)皮細(xì)胞,推測這是血管瘤快速增殖的原因。研究還證實血管瘤的自行消退是內(nèi)皮細(xì)胞凋亡所致,目前已發(fā)現(xiàn)多種凋亡調(diào)控蛋白和因子在血管瘤組織中表達(dá),如Bcl-2家族的Bax,Bad,Bcl-xl,Bak基因等。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)Fas蛋

3、白在血管瘤組織中大量表達(dá),并且定位于內(nèi)皮細(xì)胞；血管瘤組織中除存在Fas蛋白大量表達(dá),還有表達(dá)Fas配體(Fas Ligand,FasL)的活化T細(xì)胞數(shù)量增多,由此推斷血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能是表達(dá)FasL的活化T細(xì)胞誘導(dǎo)并通過Fas/FasL途徑發(fā)生,本課題旨在探討表達(dá)FasL的活化T細(xì)胞能否誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞通過Fas/FasL途徑發(fā)生凋亡。 第一部分 嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性 研究目的：探討體外分離培養(yǎng)和

4、純化嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的方法,對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定并檢測其純度,觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性。 研究方法：收集第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院和上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的14例新鮮嬰幼兒血管瘤組織,無菌條件下立即放置于含有D-Hank's液的培養(yǎng)管中,放置于4℃冰盒中保存,運(yùn)至細(xì)胞培養(yǎng)室,采用改良組織塊法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)成功后,在相差顯微鏡下刮除非內(nèi)皮細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞鋪滿皿底,運(yùn)用免疫組化Envision法對內(nèi)皮細(xì)

5、胞進(jìn)行鑒定；流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮細(xì)胞純度；微格法對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)并繪制細(xì)胞生長曲線。 研究結(jié)論：采用改良組織塊法可以分離培養(yǎng)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞,培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞,傳代后細(xì)胞純度較高,培養(yǎng)的細(xì)胞有“管腔形成”現(xiàn)象。 第二部分 嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Fas、FasL的檢測 研究目的：運(yùn)用流式細(xì)胞儀和熒光定量RT-PCR法檢測培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Fas、FasL的表達(dá)。 研究方法：將傳代的血管瘤

6、內(nèi)皮細(xì)胞和復(fù)蘇后傳代的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株接種至培養(yǎng)皿,常規(guī)培養(yǎng)1周后,用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞,離心(1000 r/min,5min)收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測血管瘤和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Fas(+)、FasL(+)細(xì)胞數(shù),并和Jurkat細(xì)胞進(jìn)行對照；熒光定量PCR法檢測血管瘤和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Fas、FasL,mRNA表達(dá)量,并和人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(Jurkat細(xì)胞)Fas mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較。Fas引物：上游5'-TTGCTA

7、GATTATCGTCCAAAAGTGT-3',下游5'-GCACTTGGTGTTGCTGGTGAGT-3',產(chǎn)物大小205bp。FasL引物：上游5'-TTCAGCTCTTCCACCTACAGAAGGA-3',下游5'-TCACTCCAGAAAGCAGGACAATTC-3';產(chǎn)物大小219bp。內(nèi)參：上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',下游5'-TCCACCACCCTGTrGCTGTA-3',產(chǎn)物大小450bp。反

8、應(yīng)條件設(shè)置為：95℃ 3min,{95℃20s,61℃20s,72℃ 30s}×50個循環(huán),72℃ 5min,55℃-95℃(溶解曲線)。 研究結(jié)論：嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)Fas,而FasL的表達(dá)量很低或幾乎不表達(dá)。 第三部分 可溶性FasL誘導(dǎo)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實驗 研究目的：探討不同劑量sFasL誘導(dǎo)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的情況；觀察100ng/ml sFasL誘導(dǎo)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及中和

9、抗體NOK-2阻斷sFasL誘導(dǎo)凋亡的作用,并和人臍靜脈細(xì)胞和人Jurkat細(xì)胞進(jìn)行對比；Western Blot法檢測sFasL誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡后,活化Caspase3,8,9的表達(dá)。 研究方法： (1)體外培養(yǎng)的人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入5ng/ml、20ng/ml、100ng/ml三種不同劑量的sFasL,與細(xì)胞分別培養(yǎng)6h、18h和36h后,流式細(xì)胞儀檢測血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù),常規(guī)培養(yǎng)的血管瘤

10、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)作陰性對照； (2)體外培養(yǎng)的人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈細(xì)胞系培養(yǎng)基中分別加100ng/ml劑量的sFasL、100ng/ml sFasL+10ng/μl中和抗體NOK-2：人Jurkat細(xì)胞株培養(yǎng)基中加入5ng/ml sFasL,5ng/ml sFasL+10ng/μl中和抗體NOK-2,三種細(xì)胞加入不同的作用因素常規(guī)培養(yǎng)18h后,用流式細(xì)胞儀檢測三種細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù),三種細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)的凋亡細(xì)胞數(shù)作陰性對照,觀

11、察sFasL誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的情況以及中和抗體NOK-2對sFasL誘導(dǎo)凋亡的阻斷作用,并和sFasL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行對比。 (3)sFasL誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡后,Western Blot法檢測活化Caspase3,8,9的表達(dá),常規(guī)培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞活化Caspase3,8,9表達(dá)量作陰性對照。 研究結(jié)論： (1)sFasL在體外可誘導(dǎo)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡,

12、凋亡誘導(dǎo)作用和sFasL劑量相關(guān),與作用時間關(guān)系不明顯。 (2)sFasL能夠誘導(dǎo)不同F(xiàn)as(+)靶細(xì)胞發(fā)生凋亡,但不同細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)不同：人Jurkat細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)最高,血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞其次,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)最少；sFasL中和抗體NOK-2可阻斷sFasL誘導(dǎo)不同細(xì)胞的凋亡。 (3)sFasL誘導(dǎo)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡后,Caspase 8和Caspase 3有活化條帶出現(xiàn),而Caspase 9活化條帶與陰

13、性對照組差異不明顯,表明sFasL能夠誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,并且是通過Fas/FasL途徑發(fā)生凋亡。 第四部分 人淋巴瘤T細(xì)胞誘導(dǎo)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實驗 研究目的：檢測IL-12刺激后人淋巴瘤T細(xì)胞株(H9細(xì)胞)FasL的表達(dá)量,觀察表達(dá)FasL的H9細(xì)胞在體外誘導(dǎo)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力。 研究方法： (1)將25ng/ml的IL-12加入H9細(xì)胞培養(yǎng)液中,使其刺激活化,用流式細(xì)胞

14、儀檢測表達(dá)FasL細(xì)胞的數(shù)量并使用熒光定量RT-PCR檢測H9細(xì)胞FasLmRNA的表達(dá)量,未刺激活化組的FasL細(xì)胞數(shù)量和FasLmRNA表達(dá)量作陰性對照。 (2)實驗分兩組:A組預(yù)先用25ng/ml的IL-12加入H9細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)12h,然后將活化H9細(xì)胞與人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)18h。B組預(yù)先用25ng/ml的IL-12加入H9細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)12h,然后加入10ng/μl sFasL中和抗體NOK-2孵育1h,再和人