模式生物——秀麗隱桿線蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的建立.pdf

1、秀麗隱桿線蟲(chóng)學(xué)名為Caenorhabditis elegans，簡(jiǎn)稱C.elegans，屬于線形動(dòng)物門、線蟲(chóng)綱動(dòng)物。秀麗隱桿線蟲(chóng)本身在自然狀態(tài)下與人類的關(guān)系不大，它生活在世界各地的泥土中，以細(xì)菌為食，容易人工養(yǎng)殖，對(duì)人、動(dòng)物和植物沒(méi)有危害。秀麗隱桿線蟲(chóng)成蟲(chóng)長(zhǎng)1mm左右，全身透明，研究者很容易在顯微鏡下對(duì)其細(xì)胞和組織進(jìn)行跟蹤觀察。秀麗隱桿線蟲(chóng)作為一種模式生物，已廣泛應(yīng)用于寄生性線蟲(chóng)基因功能的研究以及寄生性線蟲(chóng)疫苗候選抗原基因的表達(dá)，但在我

2、國(guó)這方面的研究起步相對(duì)較晚。本研究通過(guò)秀麗隱桿線蟲(chóng)體培養(yǎng)特性、Actin—1啟動(dòng)子基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建及綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，建立秀麗隱桿線蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步表達(dá)寄生蟲(chóng)抗原提供良好的技術(shù)平臺(tái)。
　　 本實(shí)驗(yàn)對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)形態(tài)、培養(yǎng)條件以及保存方面進(jìn)行了研究。將同量秀麗隱桿線蟲(chóng)分別接種于涂有大腸桿菌(OP50)的NGM培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、LB+膽固醇培養(yǎng)基上，16℃培養(yǎng)72h后，肉眼可見(jiàn)有大量蟲(chóng)體在NGM培養(yǎng)基表面蠕

3、動(dòng)，鏡檢有大量大小不同的幼蟲(chóng)，說(shuō)明NGM培養(yǎng)基比較適合蟲(chóng)體生長(zhǎng)。
　　 把同量秀麗隱桿線蟲(chóng)接種于涂有大腸桿菌(OP50)NGM培養(yǎng)基中，分別置4℃、16℃和37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，觀察蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育情況，結(jié)果表明，16℃培養(yǎng)條件下蟲(chóng)體生長(zhǎng)發(fā)育良好，可見(jiàn)大量成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)。同時(shí)把秀麗隱桿線蟲(chóng)蟲(chóng)卵接種于涂有大腸桿菌(OP50)NGM培養(yǎng)基中，置16℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，觀察蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育情況；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3天后觀察到有蟲(chóng)體孵化出

4、來(lái)，蟲(chóng)體大小相近且生長(zhǎng)良好，這樣可以獲得符合試驗(yàn)要求的同期蟲(chóng)體。
　　 將欲保存的蟲(chóng)體分別置于10％的二甲基亞砜、10％的甘油(S緩沖液溶解)、30％的甘油(S緩沖液溶解)、不加任何物質(zhì)直接放入—80℃凍存，保存兩個(gè)月后取出蟲(chóng)體，解凍后鏡檢和培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，30％甘油溶液—80℃冰箱中保存蟲(chóng)體是比較方便可行的保存方法。
　　 把培養(yǎng)的蟲(chóng)體置普通顯微鏡下觀察，雌雄同體成蟲(chóng)長(zhǎng)1mm左右，它通身透明，頭部較粗尾端較細(xì)，在固體培養(yǎng)基表

5、面蠕動(dòng)緩慢，但在液體中運(yùn)動(dòng)較快。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體腸道部位可發(fā)出自發(fā)性熒光，且隨著蟲(chóng)齡的增加自發(fā)性熒光由黃綠色變?yōu)辄S色。
　　 為獲取秀麗隱桿線蟲(chóng)特異性表達(dá)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，我們參照己發(fā)表的秀麗隱桿線蟲(chóng)Act—1基因序列設(shè)計(jì)引物，以秀麗隱桿線蟲(chóng)基因絹DNA為模板.進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出的特異性DNA條帶長(zhǎng)度略小于300 bp。將PCR產(chǎn)物與pUCm—T載體連接后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆

6、。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行SalⅠ、HindⅢ雙酶切和PCR鑒定，對(duì)鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序。序列分析表明，Act—1啟動(dòng)子基因其序列高度保守，與Genebank報(bào)道的序列一致，且包含真核細(xì)胞基因啟動(dòng)子的一些分散的保守序列，如TATA框、GATA框、CACCC框、AP1、CAAT框和多個(gè)GC框等，其中CAAT框和GC框均屬于上游控制元件，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在原核生物中比較常見(jiàn)的—35序列、SP1等重要序列。
　　 為了實(shí)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲(chóng)肌動(dòng)蛋白(Act—

7、1)啟動(dòng)子指導(dǎo)外源基因在特定組織中特異性表達(dá)，pEGFP—N1真核表達(dá)載體經(jīng)AseⅠ和NheⅠ雙酶切去掉CMV啟動(dòng)子序列，補(bǔ)平自連成載體pEGFP—4.1(4.1kb)。利用PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)的HindⅢ酶切位點(diǎn)和T載體多克隆位點(diǎn)中的XhoⅠ，將秀麗隱桿線蟲(chóng)的Act—1啟動(dòng)子序列克隆入同樣經(jīng)過(guò)HindⅢ和XhoⅠ作用后的pEGFP—4.1載體上。所構(gòu)建的載體命名為pAct—EGFP，總長(zhǎng)約為4.4kb。連接篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行酶切鑒定。同

8、時(shí)，我們利用雙酶切方式將Act—1啟動(dòng)子序列克隆入同樣經(jīng)過(guò)雙酶切作用后的pEGFP—N1載體上，構(gòu)建了含CMV和Act—1的雙啟動(dòng)子真核表達(dá)載體pCMV—Act—EGFP。
　　 為了探討單啟動(dòng)子和雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在秀麗隱桿線蟲(chóng)中的GFP表達(dá)效果，將上述構(gòu)建好的兩種高濃度質(zhì)粒與秀麗隱桿線蟲(chóng)混勻后浸泡，即采用RNAi by soaking的方法，同時(shí)設(shè)立對(duì)照，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)48h試驗(yàn)組蟲(chóng)體有特異性綠色熒光且亮度

9、較強(qiáng)，表明有GFP的表達(dá)；培養(yǎng)72h后蟲(chóng)體熒光亮度仍然很亮。GFP主要集中在蟲(chóng)體的皮層、副皮層中，蟲(chóng)體前端尤為明顯。與單啟動(dòng)子比較，發(fā)現(xiàn)含有兩個(gè)啟動(dòng)子元件的試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度更強(qiáng)一些，說(shuō)明采用雙啟動(dòng)子可以提高目的基因的表達(dá)效率。
　　 為了比較不同轉(zhuǎn)化方式對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)表達(dá)EGFP的影響，將pBluescriptSK+表達(dá)載體和pcDNA—EGFP載體上的EGFP序列分別經(jīng)Bam HI和NotⅠ雙酶切，連接篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行酶切鑒

10、定構(gòu)成pB—EGFP表達(dá)載體。pB—EGFP表達(dá)載體和T載體上的Act—1啟動(dòng)子序列分別經(jīng)PstⅠ和SalⅠ雙酶切，連接篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行酶切鑒定正確后構(gòu)建成pB—Act—EGFP真核表達(dá)載體。將該載體通過(guò)兩種方式導(dǎo)入蟲(chóng)體：一為電轉(zhuǎn)化至沙門氏菌中，通過(guò)減毒沙門氏菌攜帶該載體侵染秀麗隱桿線蟲(chóng)；另一為通過(guò)電穿孔法來(lái)進(jìn)行表達(dá)。
　　 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，兩組蟲(chóng)體培養(yǎng)24h后綠色熒光亮度較弱，培養(yǎng)48h蟲(chóng)體特異性綠色熒光亮度較強(qiáng).表明有