捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ES15-ES24在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的表達(dá)特性研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病是危害牛、羊等反芻動(dòng)物的主要寄生蟲病,其病原是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲,成蟲以宿主的血液和粘膜為食,導(dǎo)致動(dòng)物貧血、消瘦、發(fā)育不良、生長緩慢甚至死亡,給畜牧業(yè)帶來重大損失。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的控制主要靠廣譜驅(qū)蟲藥物,化學(xué)藥物過度和長期使用導(dǎo)致抗藥蟲株不斷出現(xiàn),同時(shí)也造成了肉制品藥物殘留和環(huán)境污染,尋找新的控制方法尤其是疫苗的開發(fā)顯得十分迫切。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在宿主體內(nèi)的寄生過程或體外培養(yǎng)的過程中可以向體外分泌產(chǎn)生多種分子,這些分子被命名為分泌

2、排泄產(chǎn)物(Excretory/Secretory product, ESP),由于分泌排泄抗原(ES抗原)直接暴露于宿主免疫系統(tǒng),是最有可能激發(fā)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫的靶抗原之一,成為寄生蟲抗原成分研制的熱點(diǎn)。
　　本研究以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲寄生階段釋放的ES15/24抗原為研究對(duì)象,以秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)作為模式生物,進(jìn)行捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分泌排泄抗原ES15/24轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可行性研究,以為寄生性線蟲的

3、疫苗研制提供技術(shù)支持。利用PCR技術(shù)從C. elegans基因組中克隆得到C. elegans腸道表達(dá)基因:sre-49、acdh-7、cpr-1的5’側(cè)翼區(qū)作為表達(dá)外源基因的候選啟動(dòng)子篩選對(duì)象,用以在C. elegans體內(nèi)表達(dá)ES抗原,將sre-49、acdh-7、cpr-1的5’側(cè)翼區(qū)序列克隆到表達(dá)載體pPD-95.77, GFP基因的上游,利用顯微注射技術(shù)轉(zhuǎn)入C. elegans的性腺,通過檢測(cè)報(bào)告基因EGFP的表達(dá)情況分析其作

4、為啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄外源基因的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):sre-49基因的5’側(cè)翼區(qū)啟動(dòng)功能較弱,GFP表達(dá)量低;在acdh-7基因的5’側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄下,GFP能夠在蟲體的咽部和腸道特異性表達(dá),但表達(dá)呈區(qū)段性,即咽部、咽腸交接部及腸道末端呈現(xiàn)較高強(qiáng)度的表達(dá),表達(dá)量和表達(dá)強(qiáng)度因蟲體個(gè)體不同有一定差異;而cpr-1基因的5’側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄功能則強(qiáng)而穩(wěn)定,GFP可以在除胚胎期外所有階段蟲體的整個(gè)腸道表達(dá),尤其4期幼蟲(larve4, L4)和成蟲階段表達(dá)量特別

5、高。根據(jù)GFP表達(dá)的組織定位、L4幼蟲和成蟲階段GFP表達(dá)的強(qiáng)度和穩(wěn)定性,最后選擇cpr-1基因的5’側(cè)翼區(qū)作為C. elegans表達(dá)ES蛋白的啟動(dòng)子。根據(jù)已發(fā)表的分泌排泄抗原基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,以H. contortus,總RNA為模板,用RT-PCR方法分別擴(kuò)增出大小為400bp和600bp的產(chǎn)物。序列分析結(jié)果表明:與已發(fā)表的的序列一致。將目的基因插入到重組質(zhì)粒Cpr1-pPD-95.77中,構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒cprl-ES1

6、5/24-pPD-95.77。通過顯微注射技術(shù)將cpr1-ES15-pPD-95.77與marker質(zhì)粒PRF4共注射到C. elegans的性腺,通過紫外輻照的方法獲得可穩(wěn)定遺傳蟲株。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因C. elegans進(jìn)行單蟲PCR、RT-PCR及western-blot分析發(fā)現(xiàn),ES15基因能夠在C. elegans體內(nèi)轉(zhuǎn)錄,可以在ES15轉(zhuǎn)基因C. elegans腸道內(nèi)檢測(cè)到綠色熒光信號(hào);而ES24轉(zhuǎn)基因蟲體不能檢測(cè)明顯的熒光信號(hào),

7、可能由于ES24基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)蟲體有毒性,具體原因有待進(jìn)一步的研究。為分離純化秀麗隱桿線蟲表達(dá)的ES15重組蛋白,在ES15抗原成功的在秀麗隱桿線蟲表達(dá)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)重組載體cpr-15’側(cè)翼區(qū)::GFP進(jìn)行了改造,即添加了His標(biāo)簽或?qū)S15基因下游的GFP終止,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,改造后的ES15的表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)量與改造前基本一致。但有關(guān)蟲體轉(zhuǎn)基因目的蛋白的純化和提取條件,仍需要進(jìn)一步的摸索和優(yōu)化。綜上,本實(shí)驗(yàn)首次利用顯微注射技