棉花棕色纖維基因Lc1的圖位克隆及原花色素合成和纖維棕色呈色的調(diào)控.pdf

1、彩色棉是一種能在纖維發(fā)育過程中合成和積累色素且成熟纖維具有天然色彩的棉花材料，是天然彩色纖維的主要來源。彩色棉由于具有天然色彩，在紡織加工過程中不需要漂白和印染處理，極大的減少了紡織加工的能耗水耗，同時也避免了紡織品中有機染料和無機離子殘留對人體的傷害。近年來，隨著人們的環(huán)保意識和綠色消費觀念的增強，天然彩色棉及其紡織品越來越受到消費者們的青睞。但天然彩棉存在的產(chǎn)量低、品質(zhì)差、色澤單一等問題，嚴重影響了我國彩棉產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展。
　

2、　棕色棉是目前應用最廣泛的一類彩色棉。研究表明，深棕色纖維的顏色受Lc1控制，棕色棉纖維中的棕色色素是類黃酮家族的原花色素(PA，Proanthocyanidins)。但未見成功克隆出Lc1的報道，且棕色纖維中PA合成的調(diào)控機制也尚不清楚。揭示棉花纖維色素合成及纖維呈色的調(diào)控機理，可以為彩色棉的纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的改良提供理論依據(jù)，對推動我國彩棉產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重大意義。
　　在高等植物中，PA的合成主要由MYB、bHLH和WD40三類轉(zhuǎn)錄

3、因子形成的三元復合體共同調(diào)控。在擬南芥棕色種皮中，參與調(diào)控PA合成的這三類轉(zhuǎn)錄因子分別是TT2、TT8和 TTG1。其中，TT2在擬南芥種皮的PA合成中起決定性作用，它能單獨激活下游PA結構基因的表達。TT8是擬南芥 bHLH第三(Шf)亞家族的轉(zhuǎn)錄因子，與TT2共同作用時，可顯著增強對下游靶標基因的激活效應。
　　為研究棉花PA合成和纖維呈色的調(diào)控機理，本論文全面鑒定了棉花TT2和TT8同源基因，通過表達分析、棉花轉(zhuǎn)基因、煙草瞬

4、時表達，以及棕色纖維基因(Lc1)的精細定位，揭示了棉花TT2和TT8同源基因與棕色纖維PA合成和纖維棕色呈色的關系。主要結果如下：
　　1.棉花TT2同源基因的克隆、表達分析及功能驗證
　　以擬南芥TT2氨基酸序列為探針，在雷蒙德氏棉的基因組中共找到21個相似蛋白。進化分析表明，其中5個蛋白(Gorai.001G015200、Gorai.010G087200、Gorai.001G020600、Gorai.001G02040

5、0和Gorai.001G020500)與擬南芥TT2聚為一簇，可能是棉花的TT2同源蛋白，將5個棉花TT2同源蛋白分別命名為GrTT2-1～5。從陸地棉 T586的A、D亞基因組中克隆出5對棉花TT2同源基因(GhTT2s，分別是GhTT2-1A/D、GhTT2-2A/D、GhTT2-3A/D、GhTT2-4A/D、GhTT2-5A/D)。序列分析表明來源于不同亞基因組的同對基因(直系同源)序列高度相似，旁系同源基因間的序列差異較大。<

6、br>　　為驗證這5對GhTT2同源基因的功能，將D亞基因組中的4個GhTT2s(GhTT2-1D～5D，除GhTT2-3D)及GhTT2-3A構建在組成型啟動子(35S)的下游，并對白色棉進行遺傳轉(zhuǎn)化。結果表明，這些轉(zhuǎn)基因棉花的愈傷組織均能被PA的特異染色劑DMACA染成藍色，其愈傷組織中PA的含量約是野生型的5-10倍。以上結果表明，克隆的5對棉花GhTT2s基因都有促進PA合成的功能。
　　通過qRT-PCR方法檢測這10個

7、GhTT2s在白色和棕色陸地棉的各組織及不同發(fā)育時期纖維中的表達水平。結果表明，有2對GhTT2s(GhTT2-1A/D和GhTT2-2A/D)在兩種棉花各組織中的表達模式相似，主要在胚珠中優(yōu)勢表達。有2對GhTT2s(GhTT2-3A/D和 GhTT2-4A/D)主要在兩種棉花材料的特定組織中表達。GhTT2-3A只在棕色棉的纖維中高水平表達，而GhTT2-3D主要在白色棉的胚珠中表達；GhTT2-4A主要在棕色棉的花瓣中表達，GhT

8、T2-4D主要在白色棉的葉片中表達。而GhTT2-5A/D在兩種棉花的各組織中均檢測不到表達信號。在纖維發(fā)育的過程中，除GhTT2-3A外，其它9個GhTT2同源基因幾乎都無表達信號。GhTT2-3A在棕色棉纖維發(fā)育的不同時期均有高水平表達，同時纖維中有大量的PA合成和積累。這些結果表明，棕色陸地棉中的10個GhTT2同源基因在其各組織中的表達模式不同。
　　進一步檢測這10個基因在RIL群體的棕色纖維和白色纖維中的表達，結果表明

9、GhTT2-3A無論是在棕色纖維總cDNA池及各個單株中均有高水平的表達，而在白色纖維中則不表達，其它9個GhTT2同源基因在這兩種棉花纖維中也都未檢測到表達信號。這些結果表明，GhTT2-3A的表達與棕色纖維共分離，可能參與纖維中棕色色素合成的調(diào)控。
　　2.GhTT2-3A是棕色纖維Lc1的候選基因
　　前期研究表明，深棕色纖維基因(Lc1)能上調(diào)整個PA的合成途徑，并促進棕色纖維呈色。為明確GhTT2-3A和Lc1及纖

10、維棕色呈色的關系，我們利用兩個分離群體對Lc1進行了精細定位分析。從T586的BAC文庫中篩選出一個GhTT2-3A-BAC序列，并在此基礎上尋找Lc1連鎖的分子標記。根據(jù)TT2-3A-BAC和相應D基因組序列，設計SSR引物，篩選出Lc-FT3和Lc08兩個差異顯著標記。進一步比較親本T586和渝棉1號的差異序列并設計標記引物，最終篩選出PHDA、MSF10-3Y、TT2-3A3Y、TT2-4A、ERE和Pec53l這6個差異顯著的標

11、記。同時以棕色棉T586和白色棉渝棉1號為親本建立含有270個系的RIL群體和1698株的F2代放大群體。用8個標記引物在兩個遺傳群中對GhTT2-3A和Lc1進行精細定位。結果表明，在RIL群體中Lc1位于標記MSF10A-3Y和Pec53l間，遺傳距離為0.3cM。在F2代群體中，Lc1位于遺傳標記TT2-3A3Y和TT2-4A間，兩標記的遺傳距離為0.7cM，實際距離約47kb，含有GhTT2-3A和GhTT2-5A2個基因。綜合

12、上述的表達分析和轉(zhuǎn)基因功能驗證結果，推測GhTT2-3A是棕色纖維Lc1的候選基因，可能參與棕色纖維的色素合成和棕色呈色。
　　3.纖維次生壁合成時期表達GhTT2-3A是轉(zhuǎn)基因成熟纖維呈色的關鍵
　　為明確 GhTT2-3A在棉花纖維PA合成中的調(diào)控作用，通過轉(zhuǎn)基因方法對GhTT2-3A進行了功能分析。分別將GhTT2-3A構建在不同發(fā)育時期的纖維特異啟動子 SCFP、E6、FbL2A和組成型啟動子35S的下游，利用農(nóng)桿菌

13、介導法對白色棉進行遺傳轉(zhuǎn)化。結果表明GhTT2-3A在 SCFP::GhTT2-3A、E6::GhTT2-3A和35S::GhTT2-3A的轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)育早期(11DPA)的纖維中表達水平明顯提高，同時纖維中PA含量也比野生型增加1-2倍。但在發(fā)育后期(22DPA)的纖維中，GhTT2-3A的表達明顯下降到幾乎和野生型中一樣的水平，且轉(zhuǎn)基因纖維中的PA含量也和野生型中無明顯差異。這些轉(zhuǎn)基因的成熟纖維最終呈現(xiàn)出和野生型一樣的白色。而FbL

14、2A::GhTT2-3A的轉(zhuǎn)基因棉花則相反，其成熟纖維為明顯棕色。GhTT2-3A在 FbL2A::GhTT2-3A轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)育早期(11DPA)纖維中幾乎不表達，纖維中的PA含量較野生型中也無變化，而在次生壁合成時期，GhTT2-3A在纖維中的表達水平逐漸提高，PA在纖維中合成和積累量也明顯增加。這些結果表明，GhTT2-3A在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中有促進PA合成的功能，且在纖維發(fā)育的后期(次生壁合成期)合成和積累PA是成熟纖維顯色的關鍵

15、。
　　為明確GhTT2-3A上調(diào)表達對其它基因的影響，對FbL2A::GhTT2-3A轉(zhuǎn)基因棉花和Null系(對照，GUS陰性)22DPA的纖維進行了mRNA數(shù)字表達譜分析。結果表明，與Null系相比，轉(zhuǎn)基因棉花纖維中共有170個表達差異的基因，包含149個上調(diào)基因和21個下調(diào)基因?？偣灿?7個PA合成途徑基因被鑒定出，這些基因的表達都明顯上調(diào)，包含5個GhPAL、4個GhC4H、2個Gh4CL、5個GhCHS、4個GhCHI、

16、3個GhF3H、4個GhF3’H、4個GhF3’5’H、2個GhDFR、3個GhLAR、2個 GhANS和2個 GhANR。進一步的RT-PCR驗證表明這些基因在FbL2A::GhTT2-3A轉(zhuǎn)基因棉花纖維中的表達水平都明顯高于 Null系。此外，2個GhWD40和1個GhTT8同源基因也都上調(diào)了3倍以上。這些結果表明GhTT2-3A能上調(diào)轉(zhuǎn)基因纖維中的整個PA合成途徑，同時對參與PA調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子也有一定的激活作用。
　　以上研

17、究表明，GhTT2-3A能通過激活整個PA合成途徑促進PA在轉(zhuǎn)基因纖維中合成和積累，最終使成熟纖維呈現(xiàn)出明顯的棕色。同時根據(jù)前期的表達和遺傳定位分析，認為GhTT2-3A與控制棕色色素PA合成的棕色纖維基因Lc1是同一基因。
　　4.棉花TT8同源基因的鑒定和克隆
　　基于前面的研究，為尋找棉花中與PA調(diào)控相關的TT8同源基因，通過在已測序的二倍體棉花(亞洲棉和雷蒙德氏棉)中尋找bHLH的同源基因，最終鑒定出289個棉花bH

18、LH相關的同源基因，并命名為GobHLH001-289。與擬南芥、可可中的bHLH蛋白及一些蘚類和藻類中的部分bHLH蛋白的進化分析，共分為30個亞家族，而棉花中的bHLH蛋白被分成27個亞家族。這些 bHLH蛋白中，S5a和S5b亞家族和擬南芥第三(Шf)亞家族中參與類黃酮調(diào)控的bHLH(如TT8)蛋白的序列相似性最高。這些bHLH的基因編號分別為GobHLH062、GobHLH064、GobHLH110、GobHLH123和GobH

19、LH130。
　　為明確S5a和S5b亞家族的bHLH基因結構，克隆和比較了陸地棉(A、D亞基因組)和它們的祖先二倍體棉(A和D基因組)中所有的S5a和S5b亞家族基因。結果表明，來自二倍體A和D基因組中的10個S5a和S5b亞家族bHLH基因在四倍體棉花中都有保留。其中四倍體棉中有兩個序列的發(fā)生改變，主要是GhbHLH130D中有一個15bp序列的刪除和GhbHLH062A中有一個長末端重復序列的插入。
　　5.GhTT2

20、-3A和GhbHLH110A對 PA途徑的激活具有協(xié)同作用
　　為明確GhTT2-3A和bHLH在棉花 PA合成途徑中的調(diào)控方式，通過煙草瞬時表達系統(tǒng)和雙熒光活性檢測的方法，檢測GhTT2-3A和GhbHLH110A對PA合成途徑基因GhDFR、GhLAR和GhANR的啟動子激活作用。結果表明，GhTT2-3A和GhbHLH110A分別都能單獨激活GhDFR、GhLAR和GhANR啟動子的表達，但激活效應均較弱。當GhTT2-3A

21、和GhbHLH110A二者共同作用時，其激活效果明顯增強。這些結果表明，在棉花纖維PA的合成中，GhTT2-3A和GhbHLH110A能夠協(xié)同激活PA合成途徑基因。
　　綜上所述，本研究中鑒定出了5對能促進PA合成的棉花GhTT2同源基因。其中，GhTT2-3A在棕色纖維中特異性表達，且在纖維發(fā)育的不同時期表達GhTT2-3A都能促進纖維中PA的合成和積累，但只有次生壁合成時期表達GhTT2-3A的轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維呈棕色，并獲得