‘蘋果梨’果皮花色素苷合成相關(guān)基因PyDFR和PyANS的克隆與表達分析.pdf

1、“蘋果梨”原產(chǎn)于延邊，是世界上最抗寒的、罕見大果的、能夠著紅色的優(yōu)良梨品種。為進一步從分子水平上研究‘蘋果梨’果實著色的生理機制，培育具有自然著色功能的‘蘋果梨’紅色新品種（系）提供理論依據(jù)，本試驗以‘蘋果梨’果皮為試材，采用同源克隆技術(shù)分離得到了果皮花色素苷合成途徑中二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol4-reductase，DFR）和花色素合成酶（anthocyanindin synthase，ANS）基因的全長 c

2、DNA序列，進一步對其進行了生物信息學(xué)分析；另以未套袋果實為對照，利用紫外分光光度法測定了果實著色過程中不同取樣時期的果皮內(nèi)花色素苷的含量，并應(yīng)用實時熒光定量 PCR技術(shù)對目的基因在相應(yīng)時期果皮中的表達模式進行了分析。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴根據(jù)物種水平上DFR和ANS的保守序列設(shè)計特異引物，RT-PCR擴增獲得‘蘋果梨’果皮花色素苷合成相關(guān)基因DFR和ANS的全長cDNA序列，命名為PyDFR和PyANS，GenBank登錄

3、號分別為KM588896和KM588895。序列分析結(jié)果顯示，兩基因 cDNA全長分別為1039bp和1075bp，其ORF分別編碼281個和358個氨基酸，相應(yīng)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為32KDa和40KDa，理論等電點pI為6.32和5.38。⑵利用NCBI網(wǎng)站的Blastn和Blastp工具分別對所得序列進行多重比較發(fā)現(xiàn)，PyDFR和PyANS與砂梨、西洋梨、蘋果等梨屬和蘋果屬植物的相應(yīng)基因均具有較高的相似性；利用 MEGA6軟件構(gòu)建的系

4、統(tǒng)進化聚類結(jié)果顯示：PyDFR和PyANS氨基酸序列均與砂梨、西洋梨、蘋果等薔薇科植物聚為一類，說明其親緣關(guān)系最近，進一步證實已成功克隆得到‘蘋果梨’果皮花色素苷合成相關(guān)基因PyDFR和PyANS。⑶應(yīng)用實時熒光定量 PCR技術(shù)對‘蘋果梨’果皮花色素苷合成相關(guān)基因PyDFR和PyANS在不同處理的不同取樣時期果皮中的表達模式進行了分析。結(jié)果顯示：套袋‘蘋果梨’果實解袋著色過程中PyDFR和PyANS的表達水平與花色素苷含量變化關(guān)系密切，