金屬離子和離子轉(zhuǎn)運蛋白在蠶絲成纖過程中的功能研究.pdf

1、早在五千多年前，中國古代勞動人民就開始栽桑養(yǎng)蠶，繅絲織綢。在古代中國，蠶絲已經(jīng)深入人民生活的各個角落，并被廣泛地用于服裝、藝術(shù)、印刷等領(lǐng)域，極大地豐富了當時的社會生活。時至近現(xiàn)代，蠶絲仍然在為人類社會發(fā)展服務。除了傳統(tǒng)的紡織產(chǎn)業(yè)，目前蠶絲還應用于醫(yī)藥衛(wèi)生、美容、光電、軍工、納米、環(huán)境保護等新興產(chǎn)業(yè)。
　　相較于蠶絲的應用研究，關(guān)于蠶絲蛋白是如何在家蠶體內(nèi)成纖維的研究卻薄弱得多，蠶絲纖維化的具體機制仍然未被完全闡明。已有的研究結(jié)果表

2、明，蠶絲纖維化過程實質(zhì)上就是絲蛋白內(nèi)部構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，形態(tài)由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的過程。根據(jù)目前由體外實驗獲得的一些證據(jù)，研究者提出這樣一種假說：絲蛋白由家蠶絲腺分泌后以液態(tài)形式儲存，當它流經(jīng)前部絲腺時，管徑突然變細，研究者推測管壁對于絲蛋白會產(chǎn)生剪切力，使得一部分絲蛋白分子開始整齊排布；前部絲腺的酸性環(huán)境使得絲蛋白酸化脫水，一方面使絲蛋白濃縮，另一方面使絲素蛋白的N末端發(fā)生二聚化；前部絲腺還具有適宜的金屬離子強度，金屬離子可與絲蛋白中的某些氨

3、基酸殘基發(fā)生靜電相互作用；絲素蛋白二聚化以及絲素和金屬離子的相互作用進一步將分子拉近并緊密排列，使絲蛋白形成液晶態(tài)結(jié)構(gòu)；當絲蛋白進入吐絲器后，吐絲器肌肉強大的壓縮伸展作用會提供更為強大的剪切力，將絲蛋白中多余的水分脫去；隨后，家蠶頭胸部的擺動使得絲蛋白受到拉伸力的作用，分子沿著絲纖維的長軸整齊緊密排列，從而形成固態(tài)的絲纖維。
　　根據(jù)以上假說可以看出，家蠶的前部絲腺和吐絲器實際上就是絲蛋白纖維化的場所。要探究絲蛋白纖維化過程，對于

4、這兩個組織的研究必不可少。2013年本實驗室對家蠶前部絲腺進行了蛋白質(zhì)組學研究，為本文的探討奠定了基礎(chǔ)。家蠶有幾個重要器官與蠶絲合成和分泌相關(guān)。其中，吐絲器較為微小，對其的研究還處于形態(tài)學觀察階段。而家蠶的菲氏腺是連接于吐絲器的微小腺體，功能不明。目前吐絲器、菲氏腺中基因、蛋白的表達情況以及其與絲蛋白纖維化的關(guān)系仍然未知。另外，由于模擬家蠶前部絲腺和吐絲器內(nèi)的生理生化環(huán)境十分困難，導致以上假說均是由體外實驗獲得的研究結(jié)果，體內(nèi)的真實情況

5、仍然未知。金屬離子是否能在體內(nèi)條件下與絲蛋白結(jié)合并通過與絲蛋白發(fā)生相互作用，來改變絲蛋白的構(gòu)象還不明確。
　　蠶絲蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)變化會影響蠶絲纖維的力學性能。蠶絲纖維的形成過程即是蠶絲蛋白二級結(jié)構(gòu)改變的過程，也是賦予蠶絲纖維力學性能的過程。因此如果對蠶絲纖維形成過程的諸多要素，例如金屬離子濃度等，進行調(diào)控，人為地改變蠶絲蛋白的二級結(jié)構(gòu)，那么就有可能對蠶絲纖維的力學性能進行改造。這個思路是本文研究的重點之一。
　　鑒于此，

6、本研究采用分子生物學、化學、材料力學等多種技術(shù)手段，以金屬離子為切入點，對家蠶絲纖維形成過程進行研究，并且利用轉(zhuǎn)基因的方法，人為地改變蠶絲纖維形成的離子環(huán)境，獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的、可生產(chǎn)高力學性能蠶絲的轉(zhuǎn)基因家蠶素材。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　1.家蠶吐絲器及菲氏腺的轉(zhuǎn)錄組學分析
　　本研究首先對盛食期（五齡第3天）和吐絲期（上蔟第1天）的吐絲器和菲氏腺進行了轉(zhuǎn)錄組學的研究。共在吐絲器中鑒定到11000多個基因。對

7、這些基因進行功能注釋，發(fā)現(xiàn)它們很多涉及離子結(jié)合和轉(zhuǎn)運、幾丁質(zhì)結(jié)合與代謝、表皮構(gòu)建等功能，極有可能參與了絲蛋白的纖維化。吐絲器中共鑒定到59個離子轉(zhuǎn)運蛋白基因，其中7個負責Ca2+轉(zhuǎn)運，表達量最高的離子轉(zhuǎn)運蛋白基因為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶（BmSERCA）基因；吐絲器中鑒定到大量的氫離子轉(zhuǎn)運蛋白基因，它們大多是空泡型氫離子ATP酶（V-ATPase）各個亞基的編碼基因；吐絲器中還有 Na+、K+、Zn2+、Cu2+和 PO43-轉(zhuǎn)運蛋白編

8、碼基因的表達，以上研究結(jié)果說明了吐絲器與前部絲腺一樣具有活躍的離子轉(zhuǎn)運功能，能為絲纖維形成提供適宜的生理生化環(huán)境。
　　通過轉(zhuǎn)錄組學及 GO富集分析，發(fā)現(xiàn)吐絲器與菲氏腺的差異基因均富集到了與小分子跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)的功能上，說明菲氏腺可能負責將一些小分子物質(zhì)（如水和離子）轉(zhuǎn)運到絲腺腔中。通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、基因芯片數(shù)據(jù)及RT-PCR分析，本研究鑒定到一個菲氏腺特異表達的基因BGIBMGA013432。此基因注釋為假定轉(zhuǎn)運體。
　　

9、2.家蠶吐絲器的蛋白質(zhì)組學分析
　　在轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)上，本研究進一步對上述兩個時期的吐絲器進行了蛋白質(zhì)組學研究。分別在兩個時期鑒定到1355和1315個蛋白。對蛋白進行分類后發(fā)現(xiàn)，吐絲器中與絲蛋白纖維化密切相關(guān)的蛋白（如表皮蛋白、離子轉(zhuǎn)運蛋白、肌肉運動相關(guān)蛋白和能量代謝蛋白）豐度較高。信號途徑分析發(fā)現(xiàn)吐絲器具有活躍的能量代謝、蛋白質(zhì)合成和降解過程。通過差異分析，總共在兩個時期篩選出差異蛋白232個，其中上調(diào)蛋白184個，下調(diào)蛋白48

10、個。這些差異蛋白主要參與了能量代謝、幾丁質(zhì)結(jié)合和表皮構(gòu)建過程。這說明在吐絲器中，活躍的能量代謝過程為肌肉收縮，離子和水的轉(zhuǎn)運提供豐富的能量，而幾丁質(zhì)結(jié)合和表皮構(gòu)建過程也為絲蛋白纖維化提供足夠的剪切力及自我保障。這進一步證明了吐絲器能為絲纖維形成提供適宜的生理生化環(huán)境。
　　3.家蠶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型鈣離子ATP酶的功能研究
　　BmSERCA是在吐絲器中表達量最高的離子轉(zhuǎn)運蛋白基因，本部分首先對其進行了信息分析，發(fā)現(xiàn)其高度保守。隨后克

11、隆了這個基因，對其胞內(nèi)段進行原核表達、純化、制備多克隆抗體。利用桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得了具有生物學活性的重組SERCA蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)，在細胞感染后48 h重組蛋白開始表達，到96 h表達量最大，并且分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白還具有較高的酶活。對BmSERCA基因在絲腺中的表達模式進行分析時發(fā)現(xiàn)，不管是轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平還是酶活水平，其都在前部絲腺表達量最高。為了研究 BmSERCA的功能，向上蔟期的家蠶血淋巴注射了SERCA的特異型抑制劑毒胡蘿卜

12、素（TG）。當向家蠶注射2 nmol的TG后，發(fā)現(xiàn)家蠶繭殼中的鈣元素含量上升，說明BmSERCA是調(diào)控絲腺和絲蛋白間Ca2+平衡的關(guān)鍵因子。通過FTIR分析，發(fā)現(xiàn)注射后的繭絲二級結(jié)構(gòu)含量也發(fā)生變化，螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增多，中間結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量降低，說明BmSERCA參與了家蠶絲蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
　　4.金屬離子調(diào)控絲蛋白構(gòu)象及力學性能
　　前部絲腺和吐絲器是絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的場所。本研究調(diào)查了絲腺不同區(qū)段中金屬元素含

13、量及離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達情況。結(jié)果顯示鈉、鉀、鎂、銅和鋅元素含量由后到前逐漸升高，而鈣元素含量下降。通過qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)絲腺不同區(qū)段離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量不同，其中前部絲腺和吐絲器中氫離子轉(zhuǎn)運蛋白基因、鈉鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白基因、鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白基因和銅離子轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達水平很高。
　　利用向再生絲素中添加不同濃度的金屬離子和直接向家蠶注射金屬離子的方法分別在體外和體內(nèi)條件下研究了金屬離子對絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變及力學性能的影響。

14、圓二色光譜分析表明K+能劇烈地誘導再生絲素產(chǎn)生β折疊結(jié)構(gòu)，而Na+卻不能。Ca2+與Cu2+作用于絲素蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的情況類似，都只在特定濃度下誘導β折疊結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。通過注射的方法研究了金屬離子是否在體內(nèi)參與了絲蛋白的纖維化及金屬離子與絲纖維性能的關(guān)系。利用紅外光譜比較繭絲的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)注射K+及Cu2+后絲纖維的β折疊含量顯著增加，力學性能測試發(fā)現(xiàn)注射后繭絲較對照相比更強更硬。注射 Ca2+后繭絲的無規(guī)則卷曲、螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，而β轉(zhuǎn)角結(jié)

15、構(gòu)含量下降，繭絲的延展性和韌性提高。以上的實驗結(jié)果說明，金屬離子可以在體內(nèi)調(diào)控絲蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，參與了絲蛋白的纖維化過程，并影響絲纖維的力學性能。
　　5.利用金屬離子對蠶絲纖維的力學性能進行改良
　　在前面研究的基礎(chǔ)上，本部分通過基因操作技術(shù)對蠶絲蛋白纖維化的離子環(huán)境進行了編輯，改變了蠶絲蛋白的構(gòu)象并獲得了力學性能穩(wěn)定提高的蠶絲纖維。利用紡絲管道特異啟動子BmCP231分別將家蠶的鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白BmSERCA和鈉鉀離子轉(zhuǎn)運

16、蛋白BmNKA進行了過量表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因家蠶中，相應基因和蛋白在前部絲腺得到過量表達的同時，轉(zhuǎn)基因家蠶各個組織及繭殼中的元素含量與對照相比具有顯著的差異。這說明轉(zhuǎn)基因家蠶體內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運產(chǎn)生了變化，但是并沒有對轉(zhuǎn)基因家蠶的經(jīng)濟性狀和繭與繭絲形態(tài)產(chǎn)生顯著影響。進一步分析轉(zhuǎn)基因家蠶的繭絲，發(fā)現(xiàn)過量表達BmSERCA的轉(zhuǎn)基因蠶絲β折疊和螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，相應的強度，延展性和韌性都顯著增加，其中強度增加了21％、延展性增加了54%、韌性提高

17、了73%，而剛度與對照相比沒有太大差異。過量表達BmNKA的轉(zhuǎn)基因蠶絲無規(guī)則卷曲含量增加，β折疊結(jié)構(gòu)含量下降，最終導致其力學性能發(fā)生顯著下降。這一結(jié)果說明改變家蠶絲纖維形成的離子環(huán)境可以調(diào)控絲纖維的力學性能，進而對絲纖維性能的改良提供一個全新的視角。
　　綜上所述，本論文從全新的角度、系統(tǒng)的策略、多學科的技術(shù)手段，揭示了吐絲器和菲氏腺中基因（蛋白）表達情況，證明了金屬離子在體內(nèi)條件下參與了絲蛋白纖維化過程。通過對絲蛋白纖維化形成過