組織工程化納米-羥基磷灰石-聚己內(nèi)酯人工骨支架的制備及其相關(guān)性能的研究.pdf

1、研究背景:
　　 由于創(chuàng)傷、畸形、腫瘤等疾病導(dǎo)致的骨缺損是骨科醫(yī)生所面臨的十分棘手的難題。傳統(tǒng)骨移植手段包括自體骨和異體骨移植。自體骨移植雖是骨修復(fù)策略中的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但由于其來源有限,術(shù)后并發(fā)癥多,臨床應(yīng)用有限;異體骨移植雖來源充足,但其外源性易引發(fā)機(jī)體劇烈的排斥反應(yīng),移植成功率低。因此,開發(fā)能夠彌補(bǔ)上述不足的骨移植材料是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。近些年來,飛速發(fā)展的組織工程技術(shù)也許有望擔(dān)當(dāng)此重任。
　　 研究目的:

2、>　　 本研究以無機(jī)的羥基磷灰石與有機(jī)的聚己內(nèi)酯作為原材料,使用快遞成型技術(shù)中的一種——“選擇性激光燒結(jié)技術(shù)”構(gòu)建人工骨支架,并將其與能夠持續(xù)分泌人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的種子細(xì)胞相復(fù)合,制備出組織工程化納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯人工骨支架,通過對(duì)該組織工程化人工骨支架的表征、體外生物相容性、生物活性以及骨缺損修復(fù)能力進(jìn)行檢測(cè)與分析,證明了組織工程化納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯人工骨支架的臨床應(yīng)用潛力,為其今后在骨缺損治療中的應(yīng)用奠定了一定

3、的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.制備納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯人工骨支架:
　　 本部分研究以納米級(jí)羥基磷灰石與微米級(jí)的聚己內(nèi)酯為原材料。根據(jù)反應(yīng)方程式(10Ca(NO3)2+6(NH4)2HPO4+8NH3·H2O→Ca10(PO4)6(OH)2+20NH4NO3+6H2O)制備得到納米-羥基磷灰石粉末;通過深溫冷凍粉碎技術(shù),制得微米級(jí)別的聚己內(nèi)酯粉末。通過掃描電鏡和X線衍射等表征檢測(cè),證明所制備的兩

4、種粉末材料正是本研究所需的兩種物質(zhì),同時(shí)符合了本研究對(duì)原材料粒徑大小的需求。使用Ⅴ型混合機(jī)將兩種材料的混合粉末混合5min、15min、30min、45min、1h、2h,混合完成后,掃描電鏡觀察混合的均勻度以確定最佳混合時(shí)間。根據(jù)最佳混合時(shí)間,制備出不同的質(zhì)量比的納米-羥基磷灰石與聚己內(nèi)酯混合粉末。通過對(duì)選擇性激光燒結(jié)機(jī)器參數(shù)的不斷摸索及優(yōu)化,確定出制備納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯人工骨支架的最優(yōu)參數(shù)。對(duì)制備完成的各組支架,經(jīng)宏觀觀察、

5、掃描電鏡、孔隙率、抗壓強(qiáng)度、MTT、ALP染色及茜素紅染色等檢測(cè),考察各組支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)、力學(xué)強(qiáng)度、生物相容性與生物活性,比較并篩選出綜合性能最佳的納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯支架,以作為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的樣品。
　　 2.制備轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞:
　　 本部分研究首先從新西蘭兔股骨骨髓中分離、提取出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,傳至第3代時(shí)即可用作實(shí)驗(yàn)。根據(jù)GenBank中人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(hBMP-7)的基因序列(基

6、因序列號(hào):NM001719),利用基因工程技術(shù),制備出重組腺病毒載體Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP,對(duì)該重組腺病毒載體進(jìn)行酶切與測(cè)序驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的重組腺病毒載體進(jìn)行包裝、擴(kuò)增與純化,293細(xì)胞感染劑量法測(cè)定重組腺病毒的滴度。通過體外基因轉(zhuǎn)染的方法將hBMP-7轉(zhuǎn)染到先前制得的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上,得到本研究所需的轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR、Western blot與鈣結(jié)節(jié)染色,以觀察轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞在體外環(huán)境中目的基

7、因hBMP-7的表達(dá)情況及其對(duì)骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)作用。
　　 3.納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯人工骨支架與轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞的復(fù)合
　　 本部分研究通過建立新西蘭兔股骨局部骨缺損及橈骨大段骨缺損模型,將單純聚己內(nèi)酯支架、納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯支架以及納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯+轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞支架分別植入骨缺損部位,通過植入后不同時(shí)間點(diǎn)的影像學(xué)與組織學(xué)檢查,以觀察并評(píng)定各組支架對(duì)新西蘭兔骨缺損的修復(fù)情況,并由此探

8、索納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯人工骨支架與攜帶有hBMP-7目的基因的種子細(xì)胞結(jié)合后是否具有協(xié)同促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.羥基磷灰石與聚己內(nèi)酯粉末的掃描電鏡與X線衍射結(jié)果顯示,所制備的兩種材料粉末分別達(dá)到了納米級(jí)別與微米級(jí)別,同時(shí)其與標(biāo)準(zhǔn)樣品的符合率均達(dá)到了99％以上,表明這兩種材料粉末達(dá)到了本研究對(duì)原材料的要求。Ⅴ型混合機(jī)將兩種材料的混合粉末混合5min、15min、30mi

9、n、45min、1h、2h后的掃描電鏡結(jié)果表明,1h的混合均勻度與2h相似,但較5min、15min、30min、45min均為高,因此確定,1h為最佳混合時(shí)間。將兩種材料粉末按照“納米-羥基磷灰石∶聚己內(nèi)酯=0∶100、5∶95、10∶90、15∶85、20∶80”的比例混合,根據(jù)摸索與優(yōu)化出的選擇性激光燒結(jié)機(jī)器參數(shù),以燒結(jié)納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯人工骨支架,燒結(jié)完成后,人工骨支架的掃描電鏡、孔隙率、抗壓強(qiáng)度、MTT、ALP染色及茜

10、素紅染色等試驗(yàn)結(jié)果顯示,選擇性激光燒結(jié)技術(shù)所制備出的支架具有相互連通的三維孔隙結(jié)構(gòu),隨著納米-羥基磷灰石比例的增高,人工骨支架的孔隙率略微隨之下降,但力學(xué)強(qiáng)度卻有著顯著提高,達(dá)到了7Mp; MTT的結(jié)果顯示各組人工骨支架均具表現(xiàn)出良好的生物相容性;同時(shí),ALP染色及茜素紅染色的染色結(jié)果表明含有納米-羥基磷灰石的組的人工骨支架的生物活性明顯優(yōu)于純聚己內(nèi)酯組,且隨著納米-羥基磷灰石含量愈高其生物活性愈強(qiáng)。
　　 2.從新西蘭兔骨髓中

11、分離、提取出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,傳至第3代時(shí)用作實(shí)驗(yàn)。利用基因工程技術(shù),成功構(gòu)建出重組腺病毒載體Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP,酶切測(cè)序并驗(yàn)證。結(jié)果顯示此核酸序列與PUBMED中公布的hBMP7序列(NM-001719)的編碼序列100％吻合,證明且插入片段方向正確。梯度稀釋重組腺病毒載體Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP感染293細(xì)胞,48h后熒光計(jì)數(shù)法進(jìn)行病毒感染滴度測(cè)算,得到重組腺病毒載體A

12、d-CMV-hBMP7-ires-eGFP感染滴度約為1.1×1011 v.p./ml。使用該重組腺病毒載體Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP轉(zhuǎn)染3代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后第1-3d熒光計(jì)數(shù)情況。以出現(xiàn)較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、較輕微的細(xì)胞毒性反應(yīng)以及較經(jīng)濟(jì)的病毒用量為判定標(biāo)準(zhǔn),確定該重組腺病毒載體Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為50∶1。選用最佳感染復(fù)數(shù)(MOI=50∶1)

13、感染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。以重組腺病毒載體Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP感染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,以Ad-CMV-ires-eGFP感染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為對(duì)照組,以兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不進(jìn)行處理為空白對(duì)照組,連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3周。誘導(dǎo)培養(yǎng)期間于第4、7、14、21、28d,hBMP7的PCR實(shí)時(shí)定量測(cè)定與Western blot結(jié)果表明:重組腺病毒載體Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后能夠

14、有效介導(dǎo)外源目的基因的表達(dá),且被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hBMP7表達(dá)在14d時(shí)到達(dá)高峰,在21d時(shí)開始下降。培養(yǎng)期間倒置顯微鏡下觀察到,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),逐步出現(xiàn)成骨誘導(dǎo)樣形態(tài)改變,細(xì)胞由紡錘形轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒎叫?、多角?同時(shí)有點(diǎn)狀鈣化斑出現(xiàn)。同時(shí),誘導(dǎo)培養(yǎng)第4、7、14、21、28d的ALP染色、Ⅰ型膠原PCR實(shí)時(shí)定量測(cè)定、茜素紅染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組的ALP染色陽性強(qiáng)度最高;Ⅰ型膠原的表達(dá)最多;鈣結(jié)節(jié)數(shù)量多,形態(tài)明顯,這亦表明實(shí)驗(yàn)組中

15、被轉(zhuǎn)染的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被成功的誘導(dǎo)并開始向成骨細(xì)胞方向分化。
　　 3.分別建立新西蘭兔股骨外上髁處直徑6mm,深度10mm的局部骨缺損以及新西蘭兔橈骨中段長(zhǎng)度為20mm的大段骨缺損模型,并植入相應(yīng)材料,植入后逐層縫合切口。術(shù)后常規(guī)肌肉注射抗生素7天。術(shù)后1-14天觀察顯示,各組植入材料區(qū)域均無感染現(xiàn)象,各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口愈合良好,所有切口Ⅰ級(jí)愈合。以上結(jié)果表明,植入的材料對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無明顯不良影響。術(shù)后3w、6w、9w及12w的

16、Micro-CT結(jié)果顯示,納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯+轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞支架植入組,其骨缺損修復(fù)情況較其余3組明顯為優(yōu),9w時(shí)其局部骨缺損包括皮質(zhì)骨幾乎已修復(fù)完畢,12w時(shí)骨缺損區(qū)域生成的新骨結(jié)構(gòu)完整、連續(xù),骨髓腔大部分已通,缺損幾乎完全修復(fù)。同時(shí)植入?yún)^(qū)域病理切片示,各植入組未見有明顯的不良炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng),且納米-羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯+轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞支架植入組的新骨生成量明顯多于其余各組,且在9w和12w時(shí),植入的材料已經(jīng)出現(xiàn)較為明顯的

17、降解,降解部分多被纖維組織或新生骨所替代。
　　 研究結(jié)論:
　　 選擇性激光燒結(jié)技術(shù)作為快速成型技術(shù)的一種,能夠根據(jù)計(jì)算機(jī)三維模型,進(jìn)行快速、批量的加工生產(chǎn),表明其在組織工程,乃至骨科臨床領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。
　　 以納米-羥基磷灰石與聚己內(nèi)酯粉末為原材料,通過選擇性激光燒結(jié)技術(shù)所制備出的人工骨支架,經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明,具有高度聯(lián)通的三維孔隙結(jié)構(gòu),較高的孔隙率,較為優(yōu)秀的力學(xué)強(qiáng)度,同時(shí)亦具有出色的生物相容性及生物活