流感病毒感染與粘膜免疫損傷.pdf

1、在機(jī)體的正常生理活動中，肺臟的主要功能是負(fù)責(zé)機(jī)體與外界環(huán)境的氣體交換。肺臟的這種特殊生理功能決定其成為一個對外開放的器官，這就使得肺臟時刻接受來自外界環(huán)境中非己物質(zhì)以及各種微生物的刺激。然而，令人驚訝的是，盡管呼吸道擁有巨大的表面并且每天有大量的感染因子伴隨空氣進(jìn)入呼吸道，但是呼吸道炎癥反應(yīng)卻很少發(fā)生。
　　 人的上呼吸道同腸道一樣，有大量共生菌的寄居，宿主與共生菌之間的相互作用往往是互惠互利的。已有研究發(fā)現(xiàn)，腸道共生菌在腸道免

2、疫系統(tǒng)的形成以及腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維持中都發(fā)揮著重要的作用。腸道共生菌的組份能夠刺激腸道上皮細(xì)胞表達(dá)的Toll樣受體從而保護(hù)腸道上皮組織抵抗有害病原體的感染。呼吸道共生菌是否也具有與腸道共生菌相似的功能，能夠保護(hù)呼吸道抵抗有害病原體的感染和維持呼吸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)昵？這是本論文的研究目的之一。
　　 在正常狀態(tài)下，呼吸道免疫系統(tǒng)受到免疫負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制的嚴(yán)格控制以防止有害炎癥反應(yīng)的發(fā)生。然而，當(dāng)外來病原體在呼吸道中建立有效感染時，呼吸道

3、免疫系統(tǒng)會被快速激活從而對病原體進(jìn)行清除。然而，過度的免疫應(yīng)答在清除病原體的同時會導(dǎo)致機(jī)體組織發(fā)生免疫病理損傷甚至死亡。流行性感冒，簡稱流感，是一種由流感病毒引起的呼吸道感染疾病，在世界各地經(jīng)常會有區(qū)域性和季節(jié)性的大流行。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年有300到500萬人因流感死亡。研究發(fā)現(xiàn)，過度免疫應(yīng)答導(dǎo)致的病理損傷是流感病毒感染導(dǎo)致宿主死亡的重要原因。
　　 在臨床上，流感除有咳嗽、發(fā)熱、頭疼等主要癥狀外，還會引發(fā)腹痛，惡心，嘔吐和腹瀉

4、等類似腸胃炎的并發(fā)癥，在兒童中更甚。盡管在許多流感病人中都發(fā)現(xiàn)有這些類似胃腸炎的癥狀，但其免疫學(xué)機(jī)制尚不清楚，這是本論文的另一個研究目的。
　　 在本論文中，我們?nèi)〉昧藘刹糠值慕Y(jié)果：Ⅰ、呼吸道共生菌抑制流感病毒感染誘導(dǎo)的致死炎癥；Ⅱ、呼吸道流感病毒感染誘導(dǎo)Th17細(xì)胞依賴的小腸免疫損傷。
　　 Ⅰ、呼吸道共生菌抑制流感病毒感染誘導(dǎo)的致死炎癥
　　 在本部分中，采用金黃色葡萄球菌（S.aureus）滴鼻致敏小鼠建立

5、S.aureus上呼吸道共生模型，之后利用該模型探討了呼吸道共生菌對流感病毒感染的影響。通過給小鼠滴鼻接種流感病毒PR8建立感染模型；利用H&E染色的方法檢測肺臟的病理損傷；通過ELISA的方法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞因子的水平；通過RT-PCR的方法檢測小鼠肺臟中PR8的滴度；利用流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR的方法檢測肺泡巨噬細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)；利用體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)輸和體外增殖抑制實驗驗證M2型巨噬細(xì)胞的功能：通過

6、上述一系列的研究方法，我們?nèi)〉昧巳缦聦嶒灲Y(jié)果：
　　 1、S.aureus預(yù)先致敏保護(hù)小鼠抵抗流感病毒導(dǎo)致的死亡
　　 我們采用1X107CFU的S.aureus滴鼻處理小鼠建立S.aureus小鼠上呼吸道共生模型。之后，我們給小鼠滴鼻感染致死劑量的流感病毒PR8，發(fā)現(xiàn)S.aureus預(yù)先致敏可以保護(hù)小鼠抵抗PR8感染導(dǎo)致的死亡，并且這種抵抗死亡的機(jī)制是通過減輕PR8感染所誘導(dǎo)的免疫損傷實現(xiàn)的。
　　 2、S.a

7、ureus致敏誘導(dǎo)的保護(hù)作用依賴于TLR2的活化
　　 在Tlr2-/-小鼠中，S.aureus預(yù)先致敏不能保護(hù)小鼠抵抗PR8感染導(dǎo)致的死亡。通過進(jìn)一步免疫病理分析和細(xì)胞因子檢測，我們發(fā)現(xiàn)在Tlr2-/-小鼠中，S.aureus預(yù)先致敏不能減輕PR8感染所誘導(dǎo)的免疫損傷。因此，S.aureus致敏介導(dǎo)的保護(hù)作用依賴于TLR2的活化。
　　 3、S.aureus致敏誘導(dǎo)的保護(hù)作用不依賴于病毒滴度的降低
　　 通過比

8、較對照小鼠與S.aureus致敏小鼠在PR8感染過程中肺臟中的病毒滴度，我們發(fā)現(xiàn)S.aureus致敏能夠降低PR8感染過程中小鼠肺臟中的病毒滴度。進(jìn)而，發(fā)現(xiàn)S.aureus致敏的WT小鼠和S.aureus致敏的Tlr2-/-小鼠肺臟中的病毒滴度沒有顯著性的差異。因此，S.aureus致敏誘導(dǎo)的保護(hù)作用并不依賴于抑制病毒的增殖。
　　 4、S.aureus致敏誘導(dǎo)的保護(hù)作用依賴于肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)
　　 S.aureu

9、s致敏能顯著提高AMs的數(shù)目和AMs表面TLR2的表達(dá)。采用CL2MDP-lip清除AMs，發(fā)現(xiàn)在清除AMs的小鼠中S.aureus預(yù)先致敏不能保護(hù)PR8導(dǎo)致的死亡。通過轉(zhuǎn)輸實驗，我們發(fā)現(xiàn)S.aureus致敏來源的AMs能夠恢復(fù)AMs清除小鼠抵抗PR8導(dǎo)致的死亡的能力。因此，S.aureus致敏誘導(dǎo)的保護(hù)作用是AMs依賴的。
　　 5、TLR2活化營造的肺泡環(huán)境促進(jìn)AMs向M2型巨噬細(xì)胞極化
　　 我們發(fā)現(xiàn)S.aureu

10、s致敏能夠顯著提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志Argl，F(xiàn)izzl，IL-10和TGF-β在AMs中的表達(dá)。S.aureus致敏能夠誘導(dǎo)WT小鼠BALF中IL-13的水平顯著升高，而Tlr2-/-小鼠中則沒有。因此，TLR2活化營造的肺泡環(huán)境有助于AMs向M2型巨噬細(xì)胞極化。
　　 6、M2型巨噬細(xì)胞抑制PR8感染過程中炎癥細(xì)胞的招募和增殖
　　 通過對PR8感染后BALF中的炎癥細(xì)胞進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)S.aureus致敏能夠

11、顯著降低BALF中NK細(xì)胞，中性粒細(xì)胞以及T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的數(shù)目。通過體外實驗，發(fā)現(xiàn)S.aureus致敏小鼠來源的AMs能夠顯著地抑制ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖。
　　 綜上所述，本研究通過建立S.aureus小鼠上呼吸道共生模型，發(fā)現(xiàn)S.aureus致敏能夠保護(hù)小鼠抵抗PR8感染導(dǎo)致的死亡，這種保護(hù)作用依賴于減輕PR8感染誘導(dǎo)的免疫損傷而并不依賴于抑制病毒的增殖。在S.aureus致敏過程中，TLR2活化所營造的肺泡環(huán)境能夠促

12、進(jìn)AMs向M2型巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而抑制PR8感染過程中炎癥細(xì)胞的招募和增殖。
　　 Ⅱ、呼吸道流感病毒感染誘導(dǎo)Th17細(xì)胞依賴的小腸免疫損傷
　　 在本部分中，通過給小鼠滴鼻接種流感病毒PR8建立感染模型；利用H&E染色的方法檢測組織的病理損傷；通過血清中ALT和BUN水平判斷肝臟和腎臟的功能是否正常；通過CBA的方法檢測血清中細(xì)胞因子的水平；通過PCR的方法檢測組織中流感病毒是否存在：利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞；利

13、用RT-PCR的方法檢測小腸中IL-17A，IFN-γ，IL-6，TGF-β和CCL25的表達(dá)；利用抗生素清除小鼠腸道共生菌；利用中和抗體阻斷體內(nèi)IL-17A和CCL25的作用。通過上述一系列的研究方法，我們?nèi)〉昧巳缦聦嶒灲Y(jié)果：
　　 1、流感病毒感染誘導(dǎo)小腸免疫損傷
　　 在小鼠呼吸道流感病毒感染模型中，我們發(fā)現(xiàn)PR8感染在引起肺臟免疫損傷的同時還會引起小腸免疫損傷，而不會引起肝臟和腎臟的損傷。在肺臟中能夠檢測到流感病

14、毒的存在而在小腸中卻檢測不到。因此，流感病毒呼吸道感染能夠誘導(dǎo)小腸免疫損傷，并且這種損傷不是由病毒直接感染所致。
　　 2、流感病毒感染誘導(dǎo)小腸中Th17細(xì)胞富集
　　 通過小腸組織基因芯片分析，我們發(fā)現(xiàn)PR8感染后小腸中RORγt的表達(dá)水平升高。進(jìn)而，我們發(fā)現(xiàn)伴隨著PR8感染，小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)和固有層內(nèi)淋巴細(xì)胞(LPL)中CD4+T細(xì)胞和Th17細(xì)胞逐漸增多，但在腸系膜淋巴結(jié)，縱膈淋巴結(jié)和外周血中卻沒有檢測

15、到Th17細(xì)胞的存在。同時，PR8感染會上調(diào)小腸組織中IL-17A的表達(dá)而下調(diào)IFN-γ的表達(dá)?？贵w中和IL-17A能夠抑制PR8誘導(dǎo)的小腸免疫損傷。因此，流感病毒感染引起的小腸免疫損傷是Th17細(xì)胞依賴的。
　　 3、腸道共生菌的清除減輕流感病毒感染誘導(dǎo)小腸免疫損傷
　　 通過檢測，我們發(fā)現(xiàn)PR8感染后腸道中總細(xì)菌數(shù)沒有發(fā)生改變。利用抗生素清除腸道共生菌后，PR8的感染不能誘導(dǎo)小腸免疫損傷發(fā)生，同時，在小腸IEL和LP

16、L中Th17細(xì)胞也不存在了。因此，腸道共生菌參與PR8感染誘導(dǎo)的小腸免疫損傷。
　　 4、腸道共生菌促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的招募和Th17細(xì)胞的極化
　　 通過小腸組織基因芯片分析，我們發(fā)現(xiàn)PR8感染能夠上調(diào)小腸中CCL25的表達(dá)。同時，我們發(fā)現(xiàn)PR8感染后縱膈淋巴結(jié)和小腸中CCR9+CD4+T細(xì)胞的數(shù)目都明顯增加了。進(jìn)而，我們發(fā)現(xiàn)腸道共生菌的清除會降低IL-6，TGF-β和CCL25在小腸中的表達(dá)。因此，腸道共生菌可能通過