FGF2在甲型H1N1流感病毒感染肺損傷中的作用機制研究.pdf

1、甲型H1N1流感病毒感染人體能夠造成嚴(yán)重的急性肺損傷，具有較高的發(fā)病率和致死率。甲流感染伴有多種細胞因子水平升高，這些因子在肺損傷中的作用機制也陸續(xù)被揭示。有研究發(fā)現(xiàn)，在多個組織損傷和炎癥模型中均檢測到有FGF2細胞因子水平升高，然而目前關(guān)于FGF2在流感誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用機制還未曾有報道。FGF2是一個多效性的細胞因子，不僅能夠促進細胞增殖、血管生成，而且參與組織損傷修復(fù)，誘導(dǎo)胚胎發(fā)育等多種生物學(xué)過程。本研究試圖探究FGF2在甲

2、型H1N1流感病毒感染引起的急性肺損傷中的作用機制。
　　首先分析了甲型H1N1流感患者體內(nèi)以及甲型H1N1流感病毒(A/Beijing/501/2009)感染致小鼠肺損傷模型中FGF2分子的表達水平，結(jié)果表明甲流患者血清中FGF2水平顯著高于正常人群，在小鼠肺泡灌洗液中FGF2的水平呈顯著上升趨勢。A/Beijing/501/2009感染致小鼠肺損傷模型中，用FGF2中和抗體干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)小鼠肺損傷更為嚴(yán)重，體重和存活率下降，其中

3、早期抗體干預(yù)比晚期干預(yù)小鼠發(fā)病更為嚴(yán)重。同樣的，F(xiàn)GF2缺陷小鼠表現(xiàn)出對A/Beijing/501/2009以及A/Puerto Rico/8/1934流感病毒更為易感，小鼠肺損傷更重、死亡率更高。相反，用FGF2重組蛋白給藥后，小鼠病情減輕，存活率明顯上升。以上這些結(jié)果表明，F(xiàn)GF2在甲型H1N1流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷中起保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2缺陷小鼠感染甲型H1N1流感病毒后，早期肺泡灌洗液中炎性細胞的募集量明顯少于野

4、生型小鼠，其中主要以中性粒細胞和巨噬細胞為主。同時還發(fā)現(xiàn)，在FGF2缺陷小鼠肺泡灌洗液中，多種細胞因子水平顯著低于野生型小鼠，綜合表現(xiàn)出FGF2敲除后不能激發(fā)有效的保護性炎癥應(yīng)答。以上結(jié)果預(yù)示著FGF2敲除后這些有差異的炎性細胞和細胞因子可能在流感感染致小鼠死亡的早期發(fā)揮著重要的保護功能。此外，在FGF2缺陷小鼠肺組織中檢測到較高的病毒載量，而FGF2給藥治療能夠降低小鼠肺部病毒載量。最后，我們還發(fā)現(xiàn)FGF2主要分泌細胞來源是肺上皮細胞

5、，而非中性粒細胞或者巨噬細胞。進一步研究FGF2介導(dǎo)的肺損傷中下游信號通路發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2極有可能參與了P38介導(dǎo)的MAPK信號通路，預(yù)示著該信號通路的激活很可能在保護小鼠感染緩解肺損傷中發(fā)揮重要作用。
　　近年來，關(guān)于miRNA和炎癥應(yīng)答關(guān)系的研究已經(jīng)成為感染免疫中研究的熱點，但目前對于miRNA在甲型H1N1流感病毒感染中的作用機制仍然知之甚少。是否存在關(guān)鍵的miRNA在甲型H1N1流感病毒感染中發(fā)揮重要功能還不得而知。通過檢測

6、甲型H1N1流感病毒感染誘導(dǎo)miRNA的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)甲型H1N1流感病毒感染能夠造成miRNAs表達紊亂。將表達顯著下調(diào)的miRNA對FGF2靶基因進行預(yù)測，篩選并驗證了能夠顯著抑制FGF2基因表達的miRNA，包括miR-194-5p、miR-25-3p、miR-92b-3p、miR-361-5p、miR-15b-5p、miR-22-3p、miR-17-5p、miR-503-5p和miR-16-5p。進一步驗證抑制倍數(shù)在2倍以上

7、的miRNA對FGF23'UTR的作用，我們構(gòu)建了6個FGF23'UTR短片段，分別檢測了對應(yīng)miRNA的作用，同時我們也構(gòu)建了每個miRNA在3'UTR上對應(yīng)的突變質(zhì)粒，找到了miRNA與FGF23'UTR的具體結(jié)合位點。研究發(fā)現(xiàn)miR-194-5p、miR-361-5p、miR-92b-3p、miR-25a-3p、miR-16-5p、miR-15a-5p、miR-15b-5p和miR-503-5p這8個miRNA與FGF23'UTR

8、有直接的作用，而作用位點即每個miRNA對應(yīng)的3'UTR上突變的位點。此外，在細胞和小鼠模型中驗證了這些miRNA的表達水平，并且驗證了這些miRNA的功能，找到了關(guān)鍵的miRNA調(diào)節(jié)FGF2介導(dǎo)的肺損傷保護過程，而miRNA的拮抗劑又能夠治療流感感染引起的小鼠肺損傷，因此，研究miRNA也為甲型H1N1流感病毒感染造成急性肺損傷的治療提供了新的研究方向。
　　分泌型FGF2與細胞表面高親和力受體(FGFR)結(jié)合后，能夠促進受體二

9、聚化，激活胞內(nèi)酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致下游多條信號通路的活化。FGFR包括FGFR1-4四個成員，屬于酪氨酸激酶受體亞家族。有研究發(fā)現(xiàn)用廣譜酪氨酸激酶抑制劑能夠促進流感病毒的復(fù)制，然而FGFR家族各成員是否也參與了流感病毒的復(fù)制還不是很清楚，它們是否參與了FGF2介導(dǎo)的肺損傷保護機制也有待研究。我們用甲型H1N1流感病毒（PR8和H5N1）感染人肺上皮細胞A549，檢測了四種受體成員的表達水平，發(fā)現(xiàn)FGFR1和FGFR4表達豐度較高，而FG

10、FR2和FGFR3表達相對較少，病毒感染后造成FGFR1和FGFR4表達顯著下調(diào)。進一步用siRNA介導(dǎo)的基因表達沉默，確定了FGFR1敲除能夠顯著促進甲型流感病毒的復(fù)制，而FGFR4卻沒有該效應(yīng)。相反，由慢病毒介導(dǎo)的FGFR1過表達能夠抑制流感病毒復(fù)制，而FGFR4不具有該效應(yīng)。另外，PR8感染不僅能夠下調(diào)FGFR1蛋白水平，而且能夠下調(diào)其磷酸化水平。用FGFR1選擇性抑制劑PD173074能夠明顯促進流感病毒的復(fù)制，說明FGFR1激