不同濃度氟化鈉致小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及氧化損傷的研究.pdf

1、氟是人體必需的微量元素，位于元素周期表中的第二排第七位，是目前發(fā)現(xiàn)的最活潑的非金屬元素，但攝入過(guò)量會(huì)引起氟中毒。我國(guó)是地方性氟中毒的高分布國(guó)家，除了有飲水型地方性氟中毒外，還有世界上其他國(guó)家所沒(méi)有的燃煤型和飲茶型地方性氟中毒。我國(guó)現(xiàn)有病區(qū)縣1380個(gè)，受威脅人口達(dá)1.25億人。除上海外，其余各省、市、自治區(qū)均有不同程度的氟中毒流行。氟中毒的主要表現(xiàn)為氟斑牙和氟骨癥，還可以對(duì)心血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)和器官產(chǎn)生影響。在正常情況下一定

2、量的氟可通過(guò)與白蛋白結(jié)合或以氟離子的形式穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，并可在腦內(nèi)蓄積，進(jìn)而影響腦細(xì)胞的正常生理功能。包括損傷神經(jīng)受體、使神經(jīng)細(xì)胞變形、神經(jīng)纖維髓鞘脫落、神經(jīng)遞質(zhì)和酶發(fā)生變化，從而產(chǎn)生一系列神經(jīng)系統(tǒng)的損傷表現(xiàn)，影響記憶和思維能力。近年來(lái)，一些現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，氟中毒病區(qū)兒童智力水平明顯下降，氟對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷受到關(guān)注，但其作用機(jī)制尚不清楚。
　　 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia,MG)約占膠質(zhì)細(xì)胞的

3、10％～20％，在神經(jīng)元的生理活動(dòng)中起著支持、營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)及修復(fù)等重要功能。MG主要為分枝狀和阿米巴狀，不同形態(tài)代表不同的功能狀態(tài)。正常生理狀況下，MG處于非活化狀態(tài)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、炎癥、或受外來(lái)物刺激時(shí)，可以活化，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。MG的活化有直接和間接兩種作用方式。直接作用是受各種刺激后，MG可表達(dá)各種抗原，行使抗原提呈細(xì)胞的功能；間接作用是MG可分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、炎性或抑炎性細(xì)胞因子、趨化因子等，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)其它

4、細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞間免疫調(diào)節(jié)。但MG的過(guò)度激活可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子及活性氧產(chǎn)物，其異常激活及其所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是多種環(huán)境因素所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要因素。因此，本研究以MG為切入點(diǎn)，了解氟是否可誘導(dǎo)MG活化及其所致氧化損傷情況，探討氟致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制。
　　 材料和方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法
　　 （一）細(xì)胞培養(yǎng)
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞系(BV-2)購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM

5、高糖培養(yǎng)基（含10％胎牛血清，1×105U/L青、鏈霉素），5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合時(shí)，以1：3進(jìn)行傳代。
　　 （二）細(xì)胞增殖活力檢測(cè)
　　 采用MTT比色法。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和9個(gè)染氟組，每組設(shè)置三個(gè)平行樣。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度(OD)值，細(xì)胞活力用還原率表示。還原率越高，表示細(xì)胞增殖活力越強(qiáng)。
　　 （三）IntegrinαM(OX-42)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)
　　

6、 采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法，觀察BV-2細(xì)胞活化后特異性標(biāo)志物OX-42的表達(dá)情況。細(xì)胞呈棕色者為陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、染氟組和脂多糖(LPS)陽(yáng)性對(duì)照組。
　　 （四）細(xì)胞氧化損傷檢測(cè)
　　 1、細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量的測(cè)定
　　 采用二硫代二硝基甲酸比色法應(yīng)用GSH測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH含量，同時(shí)應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度以校正細(xì)胞內(nèi)GSH的含量。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組和染氟組。
　　

7、 2、細(xì)胞內(nèi)超氧化物岐化酶(SOD)含量的測(cè)定
　　 采用黃嘌呤氧化酶法用SOD測(cè)試盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD的含量，同時(shí)應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度以校正細(xì)胞內(nèi)SOD的含量。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組和染氟組。
　　 3、細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量的測(cè)定
　　 采用硫代巴比妥酸法應(yīng)用MDA檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA的含量，同時(shí)應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度以校正細(xì)胞內(nèi)MDA的含量。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組和染氟組。

8、　　 4、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的相對(duì)含量的測(cè)定
　　 采用2’，7’-二乙酰二氯熒光素(DCFH-DA)法，用FACScan流式細(xì)胞儀于488nm激發(fā)波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)弱用來(lái)代表ROS的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組和不加染料DCFH-DA探針的對(duì)照組，即2個(gè)對(duì)照組和染氟組。
　　 5、細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫(H2O2)含量的測(cè)定
　　 采用比色法應(yīng)用H2O2試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中H2O2的含量。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組和染氟

9、組。
　　 （五）細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮(NO)含量的測(cè)定和細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)含量的測(cè)定
　　 1、NO含量的測(cè)定
　　 采用硝酸還原酶法應(yīng)用NO試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組和染氟組。
　　 2、NOS活力的測(cè)定
　　 采用NOS試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中NOS活力，同時(shí)應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度以校正細(xì)胞內(nèi)NOS的含量。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組和染氟組。
　　 （六

10、）細(xì)胞內(nèi)硝基酪氨酸(NT)的測(cè)定
　　 采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NT含量。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組和染氟組。
　　 二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Kolmogorov-Smirnov進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性分析。組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，用Levene Statistic進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett T3檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Pearson C

11、orrelation或非參數(shù)相關(guān)。
　　 結(jié)果:
　　 一、細(xì)胞增殖活力的改變
　　 實(shí)驗(yàn)分組為加入濃度為0.5、1、5、10、20、50、100、120mg/L的氟化鈉，分別染毒24、48和72h。BV-2細(xì)胞染毒24h、48h和72h后，隨著染氟濃度的增加，還原率逐漸降低。BV-2細(xì)胞染毒24h、48h后，50mg/L以上NaF染毒組細(xì)胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);BV-2染毒72h后，2

12、0mg/L以上NaF染毒組細(xì)胞活力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，但在0.5mg/L NaF組細(xì)胞活力出現(xiàn)一個(gè)顯著升高現(xiàn)象(p＜0.01)。
　　 二、氟化鈉對(duì)BV-2細(xì)胞的活化作用
　　 分別用1、5、10、20mg/L的NaF染毒BV-2細(xì)胞24h后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法，觀察BV-2細(xì)胞活化后特異性標(biāo)志物OX-42的表達(dá)情況，同時(shí)用LPS做陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈小圓型或椎型帶突觸，5～

13、20mg/L, NaF染毒后，大部分細(xì)胞活化，胞體變大變圓，胞漿中有棕色OX-42表達(dá)。
　　 三、氟暴露對(duì)BV-2氧化應(yīng)激水平的影響
　　 BV-2細(xì)胞染毒24h后，50mg/L NaF處理組細(xì)胞內(nèi)GSH的含量顯著增高，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；1、2、10、50mg/L NaF處理組細(xì)胞SOD活力顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；2、50mg/L NaF處理組細(xì)胞內(nèi)的MDA含量

14、顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；1、2、10、50mg/L NaF染毒24h組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。10、50mg/L NaF染毒48h組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)液中H2O2含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 四、氟暴露對(duì)BV-2細(xì)胞內(nèi)NOS活力和培養(yǎng)液中NO含量的影響
　　 BV-2細(xì)胞染毒24h后，10mg/L Na

15、F染毒組細(xì)胞內(nèi)中NOS活力顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；各氟暴露組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 五、氟暴露對(duì)BV-2細(xì)胞中NT的含量的影響
　　 BV-2細(xì)胞染毒24h后，2、10、50mg/L NaF染毒組細(xì)胞內(nèi)NT含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、一定劑量的氟可以引起小膠質(zhì)細(xì)胞的活化
　　 2、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化可以引