纖維素酶活性架構(gòu)及TrCel12A關(guān)鍵亞位點氨基酸功能研究.pdf

1、植物生物質(zhì)能發(fā)酵成生物燃料及其他生物制品是潛在的可持續(xù)能源。生物質(zhì)有效轉(zhuǎn)化利用對緩解能源危機、防止環(huán)境污染具有重要的現(xiàn)實意義?？砂l(fā)酵糖單元的高效釋放是生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料的瓶頸。植物生物質(zhì)的高效降解依賴于糖苷水解酶系統(tǒng)協(xié)同作用。其中纖維素是植物細(xì)胞壁的重要組分，是自然界最豐富的多糖。纖維素酶在降解纖維素過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。纖維素酶根據(jù)不同的序列相似性歸為不同的糖苷水解酶家族，且纖維素酶在不同家族及同一家族內(nèi)部表現(xiàn)出功能混雜性，利用結(jié)構(gòu)生

2、物信息學(xué)的方法對不同纖維素酶家族及家族內(nèi)部混雜性酶序列、結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵氨基酸分析將有助于我們了解纖維素酶識別底物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和共性規(guī)律，可以為纖維素酶的工程改造奠定理論基礎(chǔ)。本文利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的方法分析了纖維素酶家族活性架構(gòu)及混雜性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并對GH12家族混雜性酶TrCel12A活性架構(gòu)關(guān)鍵亞位點氨基酸進行定點突變及功能分析，以進一步闡明酶識別底物過程中的分子機制。本文主要內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　(1)分析不同纖維素酶家族活性架

3、構(gòu)混雜性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
　　糖苷水解酶家族30％序列分類，使得每個纖維素酶家族具有相似的結(jié)構(gòu)特征。家族內(nèi)酶分子功能執(zhí)行區(qū)域僅是催化結(jié)構(gòu)域中非常小的一部分，分析活性架構(gòu)區(qū)域序列及結(jié)構(gòu)特性對研究混雜性具有重要意義。本文研究發(fā)現(xiàn)，活性架構(gòu)區(qū)域氨基酸W、Y、N、D、E氨基酸出現(xiàn)頻率較高;構(gòu)建活性中心序列譜，每個纖維素酶家族具有不同的底物結(jié)合亞位點，保守氨基酸主要分布在-2到+1亞位點;各家族纖維素酶分子保守氨基酸識別底物糖環(huán)的氧原子模式各不相同

4、，從而使其可對結(jié)構(gòu)相近（molecular mimicry）的底物進行部分識別，這可能是各纖維素酶家族產(chǎn)生非專一性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　(2)TrCel12A酶分子活性架構(gòu)關(guān)鍵氨基酸突變及其混雜性分析
　　GH12家族TrCel12A酶分子在功能上具有混雜性，既具有纖維素酶活性，又具有木葡聚糖酶活性，同時對不同聚合度的可溶性底物也具有降解作用。有文獻報道，混雜性與酶分子與底物的部分識別密切相關(guān)。本文對位于TrCel12A酶分子活

5、性架構(gòu)部位-2和-4底物結(jié)合亞位點色氨酸進行突變。突變結(jié)果顯示，將色氨酸突變?yōu)槔野彼嵊捎谠黾恿艘粋€氫鍵從而增大了纖維素酶分子與底物CMC結(jié)合力，-4位點W7Y突變內(nèi)切纖維素酶活性提高到144％，而-2亞位點W22Y突變雖提高了纖維素酶分子與CMC以及其中間產(chǎn)物的結(jié)合力，催化動力學(xué)常數(shù)Kcat下降明顯，即產(chǎn)物釋放受到抑制，導(dǎo)致酶活力下降，因此酶活力是產(chǎn)物結(jié)合與釋放的平衡過程。根據(jù)酶分子不同位置亞位點對產(chǎn)物及其降解中間產(chǎn)物的混雜性不同影響對

6、酶分子進行理性設(shè)計，為纖維素酶的理性設(shè)計提供了新思路。
　　(3)TrCel12A酶分子活性架構(gòu)決定多底物特異性關(guān)鍵氨基酸功能研究
　　通過序列與結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn)，TrCel12A與HsCel12A酶分子序列相似度非常高(94％)，只有14個氨基酸差異，但兩種酶分子卻出現(xiàn)了功能分歧。TrCel12A既具有木葡聚糖活力又具有纖維素酶活力，而HsCel12A酶僅具有纖維素酶活力，因此這14個氨基酸的差異可能導(dǎo)致TrCel12A多底物

7、特異性。本文對位于活性架構(gòu)的T16、S63、A66位點進行突變，結(jié)果顯示T16I、S63V、A66N突變體木葡聚糖酶活力具有一定程度的下降，表明通過進一步的序列分類對尋找決定底物特異性氨基酸具有一定的指導(dǎo)意義。
　　(4)TrCel12A酶分子活性架構(gòu)關(guān)鍵氨基酸與底物相互作用機理分析
　　N20位于TrCel12A酶分子活性架構(gòu)-2亞位點位置，是其活性架構(gòu)中心部位保守氨基酸，與底物-2位糖環(huán)C2位置的羥基形成氫鍵，對結(jié)合纖維