鴨白細(xì)胞介素2（IL-2）基因的克隆和表達(dá).pdf

1、第一部分 鴨白細(xì)nfl介素2基因的克隆 目的：從PHA刺激的鴨淋巴細(xì)胞中克隆出鴨IL-2基因，進(jìn)一步進(jìn)行基因序列對(duì)比分析。 方法：以PHA刺激的鴨淋巴細(xì)胞提取的總RNA為模板，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增鴨IL-2基因的特異性引物，通過(guò)RT-PCR方法克隆目的基因片段。將純化的RT-PCR產(chǎn)物采用酶切(HindlII和BamHI)連接的方式，定向克隆至載體pQE30，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-IL2，送檢測(cè)序。應(yīng)用DNAMAN分析

2、軟件，分析測(cè)序結(jié)果與已知GenBank中鴨IL-2序列的差異性。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)所克隆目的片段長(zhǎng)748bp，經(jīng)同源性分析表明與GenBank中所報(bào)道的鴨IL-2基因序列僅存在兩個(gè)堿基的差異。 結(jié)論：成功克隆了鴨IL-2基因。第二部分 鴨白細(xì)胞介素2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá) 目的：在成功克隆鴨IL-2基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32-IL2，在表達(dá)菌株中誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。 方法：Hin

3、dlII和BamHI雙酶切載體pET32a(+)和目的基因鴨IL-2，在連接酶的作用下，將目的基因定向克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32-IL2，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)IL-2融合蛋白的表達(dá)，采用Western印跡法鑒定目的蛋白。 結(jié)果：成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32-IL2，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21，經(jīng)PAGE對(duì)比分析表明IL-2融合蛋白能在表達(dá)菌株BL21內(nèi)經(jīng)誘

4、導(dǎo)后得到表達(dá)，純化誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，通過(guò)Western印跡法證實(shí)純化蛋白即是目的蛋白。 結(jié)論：成功構(gòu)建了鴨IL-2原核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)PAGE和Western印跡法證實(shí)鴨IL-2蛋白能在原核載體pET32-IL2中誘導(dǎo)表達(dá)，為以后進(jìn)行活性分析和生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。第三部分 鴨白細(xì)胞介素2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá) 目的：將鴨IL-2基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)，構(gòu)建重組載體，并研究其在真核細(xì)

5、胞的表達(dá)情況。 方法：以pQE30-IL-2為模板，PCR擴(kuò)增出鴨IL-2基因，采用酶切(HindIII和BamHI)連接的方式將鴨IL-2基因序列定向克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3．1一IL2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，通過(guò)抗生素G418篩選出抗性細(xì)胞株，采用RT-PCR方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增出750bp的鴨IL-2編碼序列，用基因重組的方法成功構(gòu)建了真核表