豬白細(xì)胞介素4基因克隆、表達(dá)及佐劑效應(yīng)的研究.pdf

1、　 根據(jù)GenBank上已登錄的豬IL-4基因(AY294020)、利用PrimerSelect軟件和Oligo5.0軟件設(shè)計(jì)了引物，用植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)共同刺激分離的豬外周血淋巴細(xì)胞，提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增豬IL-4基因，將擴(kuò)增到的基因與pGEM-T-easy載體連接、轉(zhuǎn)化后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、酶切、PCR及測(cè)序鑒定；然后設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的表達(dá)引物，以重組質(zhì)粒pGEM-T-IL-4為模板進(jìn)

2、行擴(kuò)增，所擴(kuò)產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pGEX-4T-1、真核表達(dá)載體pcDNA3.1連接，構(gòu)建原核、真核重組表達(dá)質(zhì)粒；用ITPG分別在32℃和28℃條件下誘導(dǎo)重組原核表達(dá)載體，并提取不同誘導(dǎo)溫度下的蛋白，并對(duì)表達(dá)的蛋白分別用SephadexG-200層析柱、GST柱進(jìn)行純化、然后用MTT法檢測(cè)其生物學(xué)活性。真核表達(dá)質(zhì)粒提取純化后與TSO18、豬囊蟲(chóng)全蟲(chóng)疫苗聯(lián)合免疫豬，用ELISA法檢測(cè)免疫豬的抗體。本實(shí)驗(yàn)中成功的克隆的豬IL-4基因，用序列分

3、析軟件分析：該序列與參考序列IL-4基因核苷酸序列同源性為99﹪，氨基酸的同源性為97.8﹪，其包括一個(gè)完整的閱讀框，大小為402bp，編碼134個(gè)氨基酸；與其它豬種IL-4基因閱讀框比較顯示同一物種間基因的保守性很強(qiáng)。 研究中成功的構(gòu)建了豬pGEX-4T-1-IL-4、pcDNA3.1-IL-4表達(dá)質(zhì)粒。SDS-PAGE結(jié)果顯示重組原核表達(dá)質(zhì)粒在兩種溫度都表達(dá)分子量為38KD左右蛋白，與預(yù)測(cè)的相一致；在32℃目的蛋白主要以包涵體