豬白細胞介素4基因克隆、表達及佐劑效應的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、　 根據(jù)GenBank上已登錄的豬IL-4基因(AY294020)、利用PrimerSelect軟件和Oligo5.0軟件設計了引物，用植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)共同刺激分離的豬外周血淋巴細胞，提取總RNA，采用反轉錄PCR(RT-PCR)技術擴增豬IL-4基因，將擴增到的基因與pGEM-T-easy載體連接、轉化后，經(jīng)藍白斑篩選、酶切、PCR及測序鑒定；然后設計含酶切位點的表達引物，以重組質粒pGEM-T-IL-4為模板進

2、行擴增，所擴產(chǎn)物與原核表達載體pGEX-4T-1、真核表達載體pcDNA3.1連接，構建原核、真核重組表達質粒；用ITPG分別在32℃和28℃條件下誘導重組原核表達載體，并提取不同誘導溫度下的蛋白，并對表達的蛋白分別用SephadexG-200層析柱、GST柱進行純化、然后用MTT法檢測其生物學活性。真核表達質粒提取純化后與TSO18、豬囊蟲全蟲疫苗聯(lián)合免疫豬，用ELISA法檢測免疫豬的抗體。本實驗中成功的克隆的豬IL-4基因，用序列分

3、析軟件分析：該序列與參考序列IL-4基因核苷酸序列同源性為99﹪，氨基酸的同源性為97.8﹪，其包括一個完整的閱讀框，大小為402bp，編碼134個氨基酸；與其它豬種IL-4基因閱讀框比較顯示同一物種間基因的保守性很強。 研究中成功的構建了豬pGEX-4T-1-IL-4、pcDNA3.1-IL-4表達質粒。SDS-PAGE結果顯示重組原核表達質粒在兩種溫度都表達分子量為38KD左右蛋白，與預測的相一致；在32℃目的蛋白主要以包涵體

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