人白細(xì)胞介素26的基因克隆與表達(dá).pdf

1、一、立題依據(jù)和目的 白細(xì)胞介素26(Interleukin-26，IL-26)又稱為AK155，是2000年由Knappe等用扣除雜交(subtractivehybridization)方法在saimiri皰疹病毒(Herpesvirussaimiri，HVS)轉(zhuǎn)化的T淋巴細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)的。轉(zhuǎn)化后很多功能保留的同時(shí)，只有幾個(gè)細(xì)胞特征發(fā)生了明顯變化。最顯著的不同是轉(zhuǎn)化后對(duì)CD2的刺激呈高反應(yīng)性；另外，接受刺激后，出現(xiàn)IFN-γ高水

2、平表達(dá)，使轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞由Th2型向Th0型分化。AK155與IL-10有很高的序列同源性，屬于IL-10分子家族(IL-10、IL-19、IL-20、IL-22和IL-24)的新成員，因此人類基因組組織(Humangenomeorgnization，HUGO)建議將其命名為白細(xì)胞介素26，簡(jiǎn)稱IL-26，并得到了白介素命名委員會(huì)的確認(rèn)[2]。除了在HVS轉(zhuǎn)化的T淋巴細(xì)胞中高表達(dá)外，在其他的T細(xì)胞系和天然外周血細(xì)胞IL-26表達(dá)水平較低[

3、1，3-5]。IL-26的受體與其他已知的IL-10家族成員(IL-10，IL-19,IL-20,IL-22,IL24)的受體一樣，都屬于Ⅱ型細(xì)胞因子受體家族(theClassⅡcytokinereceptorfamily，CRF2)[6]。IL-26受體復(fù)合體是由配體結(jié)合鏈IL-20R1和非配體結(jié)合鏈IL-10R2組成的異二聚體，IL-26與其受體復(fù)合體的高親和力結(jié)合導(dǎo)致STAT1和STAT3的快速磷酸化，從而傳遞活化信號(hào)。盡管IL-

4、26受體復(fù)合體是IL-26高度特異的，不能被其它Ⅱ型細(xì)胞因子激活，但是IL-26受體復(fù)合體的亞單位卻是構(gòu)成別的Ⅱ型細(xì)胞因子受體復(fù)合體的重要組成部分。IL-10R2(CRF2-4)也是IL-10、IL-22和IFN-λ(IL-28A，IL-28B和IL-29)受體復(fù)合體的一個(gè)受體亞單位，而IL-20R1(CRF2-8)，好象是IL-26、IL-19、IL-20和IL-24共用的。雖然IL-26很可能在正常和病理血液學(xué)以及免疫學(xué)中起著重要作

5、用，其具體的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步闡明。最新研究發(fā)現(xiàn)IL-20能刺激造血系統(tǒng)，特別是多能造血干祖細(xì)胞向特異的細(xì)胞亞群分化[11]，基于IL-20和IL-26有共用受體，預(yù)測(cè)IL-26很可能也參與了造血細(xì)胞的分化過程。本研究擬采用基因工程技術(shù)構(gòu)建人IL-26基因的原核和真核表達(dá)載體，并初步探討其在大腸桿菌和哺乳細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能及探討用于基因治療的可能性奠定基礎(chǔ)。 二、方法和結(jié)果 1.人IL-26成熟肽

6、的基因克隆及其在大腸桿菌中的重組表達(dá) 取正常人新鮮外周血，提取單個(gè)核細(xì)胞，用本室制備的RNA提取試劑盒分離純化細(xì)胞總RNA。以RNA為模板，隨機(jī)六聚體核苷酸為引物，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，合成cDNA的第一鏈。根據(jù)GenBank報(bào)道的人IL-26的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增成熟人IL-26基因的兩對(duì)引物，分別在內(nèi)側(cè)上下游引物5′端加上限制性酶切位點(diǎn)EcoRI和BamHI。設(shè)計(jì)內(nèi)側(cè)上游引物時(shí)，在成熟人IL26編碼序列的上游加

7、上起始密碼子ATG，同時(shí)在上游加上保護(hù)性堿基GC，內(nèi)側(cè)下游引物加上TA，降低G+C含量，防止二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，提高重組蛋白質(zhì)的表達(dá)含量。以RT反應(yīng)產(chǎn)物cDNA為模板，用TaqDNA聚合酶進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增hIL26基因。用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，接種于含100ug/mL氨芐青霉素的LB平板。用菌落PCR和限制性酶譜分析篩選出陽(yáng)性克隆，采用ABI3100-AvantGenetic

8、Analyzer全自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)序，結(jié)果顯示，克隆的基因和預(yù)期的成熟人IL26基因完全一致，成功構(gòu)建了人IL26的重組質(zhì)粒pMD18-T/hIL26。 用EcoRI和BamHI雙酶切消化重組質(zhì)粒pMD18-T/hIL26，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化hIL26片斷，插入原核表達(dá)載體pBV220的PL啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建重組hIL26表達(dá)載體。重組子同樣用菌落PCR和限制性酶譜分析篩選出陽(yáng)性克隆，從而獲得重組陽(yáng)性質(zhì)粒pBV220

9、-hIL26。含有pBV220-hIL26的大腸桿菌(工程菌株)接種于含100ug/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，42℃誘導(dǎo)4小時(shí)，離心收集細(xì)菌，進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblotting分析。結(jié)果顯示，重組蛋白的表觀分子量約18KDa，和文獻(xiàn)報(bào)道一致，凝膠圖像分析表明重組蛋白約占菌體總蛋白的20％。Westernblotting分析，重組蛋白能和抗人IL26抗體特異性反應(yīng)，說明重組蛋白為人IL2

10、6。 為研究重組人IL26的生物學(xué)活性，進(jìn)行小規(guī)模的發(fā)酵。工程菌以1∶100接種于含有葡萄糖和甘油的LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD值約0.4-0.5，迅速轉(zhuǎn)移至42℃水浴搖床又到5小時(shí)。4℃離心收集細(xì)菌，洗滌，超聲破碎。7,000rpm離心洗滌，分離包涵體。沉淀用含0.2％的TritonX-100洗滌3次，純化包涵體。用8M尿素溶解包涵體，然后用凝膠過濾初步純化目的蛋白，SDS-PAGE分析顯示，獲得蛋白純度約90％。

11、 2.人IL-26全長(zhǎng)基因的克隆及其在COS7細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá) 為了探討IL-26用于基因治療的可行性，我們用同樣的方法從人新鮮外周血單個(gè)核細(xì)胞中成功克隆并構(gòu)建了帶有信號(hào)肽序列的重組pMD18-T/hIL26，序列測(cè)定表明所克隆的人全長(zhǎng)IL-26基因與GenBank上報(bào)道的完全一致。用SalI和EcoRI雙酶切消化重組質(zhì)粒pMD18-T/hIL26，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化hIL26片斷，插入經(jīng)相應(yīng)酶切處理的真核表達(dá)載體p

12、IRES2-EGFP的CMV啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建哺乳細(xì)胞表達(dá)載體pIRES2-EGFP/hIL26。pIRES2-EGFP/hIL26經(jīng)酶切鑒定與預(yù)期結(jié)果一致，將重組質(zhì)粒用非脂質(zhì)體試劑Fugene6轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中，熒光顯微鏡觀察可見轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞有熒光出現(xiàn)，Westernblotting分析證實(shí)hIL26基因得到了有效表達(dá)。 三、結(jié)論 1.成功克隆了人成熟IL-26基因，序列分析顯示，克隆的基因序列和文獻(xiàn)報(bào)道一致。