羅伯茨綠僵菌幾丁質合成酶與致病性和抗逆的關系研究.pdf

1、幾丁質(chitin)是真菌細胞壁的重要結構成分，它與葡聚糖一起構成細胞壁堅固的骨架，對于維持細胞形態(tài)，防止外源物的入侵等起著重要的保護作用。同時，幾丁質也是一種病原菌相關模式分子(Pathogen-Associated MolecularPattern，PAMP)，能誘導宿主的免疫應答;在一些致病真菌中（如植物病原真菌—稻瘟病菌等），幾丁質合成酶已經被發(fā)現與致病性相關。羅伯茨綠僵菌(M.robertsii），是重要昆蟲病原真菌，正在被

2、開發(fā)為真菌殺蟲劑，用于防治農業(yè)害蟲，衛(wèi)生害蟲和它們所傳播的疾病，但其存在著殺蟲速度慢和防效不穩(wěn)定的缺點，研究羅伯茨綠僵菌的致病機理可為創(chuàng)建高效安全的真菌殺蟲劑提供理論依據。目前，幾丁質合成酶與羅伯茨綠僵菌致病性相關的研究尚未被報導。為此，本文從羅伯茨綠僵菌(M.robertsii)中鑒定了所有幾丁質合成酶，并闡明了它們在發(fā)育、致病和抗非生物逆境中的功能，主要結果分述如下:
　　利用釀酒酵母(S.cerevisiae)和稻瘟病菌（M

3、.oryzae）等的幾丁質合成酶作為queries，我們從羅伯茨綠僵菌中鑒定到7個可能的幾丁質合成酶，經結構域分析(PFAM database)發(fā)現，這7個蛋白均含有典型的幾丁質合成酶結構域(domain structure);并且都有保守的CON1結構域(QxxEY, EDRxL，QxRRW)。利用來自多個真菌幾丁質合成酶的CON1序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現，羅伯茨綠僵菌幾丁質合成酶分別位于7個clades。根據結構域分析和系統(tǒng)發(fā)育研究

4、的結果，我們把它們分別命名為ChsⅠ(Maa-02999)、ChsⅡ(Maa-02740)、ChsⅢ(Maa-03168)、ChsⅣ(Maa-00137)、ChsⅤ(Maa-01111)、ChsⅥ(Maa-01099)和ChsⅦ(Maa-01112)。
　　通過表達分析我們發(fā)現，除了ChsⅥ，其他幾丁質合成酶在生長發(fā)育和致病的各個階段都表達;ChsⅤ和ChsⅦ有著類似的表達規(guī)律，在侵染階段（附著胞階段）和生長發(fā)育階段（產孢結構、芽

5、生孢子和萌發(fā)）都有比較強的表達，但附著胞階段表達量最高。為了研究幾丁質合成酶家族的生物學功能，我們構建以上7類幾丁質合成酶的敲除株和回補株。
　　在腐生階段，△ChsⅠ、△ChsⅡ、△ChsⅤ和△ChsⅦ在PDA培養(yǎng)基上生長明顯受到抑制?！鰿hsⅤ和△ChsⅦ的產孢量顯著比野生型菌株降低，與此相對應，這兩個突變體的產孢結構異常;與野生型菌株相比，突變體的分子孢子梗的數目明顯減少。掃描電鏡觀察發(fā)現，△ChsⅤ和△ChsⅦ的細胞表面疏

6、水結構(Rodletstructure)明顯受損。
　　與野生型菌株相比，△ChsⅤ和△ChsⅦ的侵染毒力明顯降低。進一步發(fā)現，△ChsⅤ和△ChⅦ的附著胞異常，附著胞內部有膨大的類似液泡的結構填充，△ChsⅤ和△ChsⅦ的附著胞膨壓與野生型菌株相比明顯降低。
　　對羅伯茨綠僵菌的7類幾丁質合成酶敲除株在非生物逆境（高溫、高滲、氧化環(huán)境和細胞壁破損處理）條件下生長速率測定發(fā)現:在高溫條件下△ChsⅡ和△ChsⅤ是致死的，△C

7、hsⅠ和△ChsⅦ明顯受到抑制;此外對來自9個門的231個真菌的幾丁質合成酶家族進行分析，發(fā)現來自盤菌亞門(Pezizomycotina)的95個物種含有ChsⅤ和ChsⅦ，進一步分析發(fā)現它們在基因組上是通過基因的串聯復制(Tandem duplication)產生的。在這95個物種中，78個是致病真菌，其中28個可以感染哺乳動物（耐高溫），剩余17個腐生真菌中，10個具有耐高溫特性，而其余7個真菌與哺乳動物病原真菌和耐高溫性真菌的親緣