綠僵菌和白僵菌防蝗菌株的分子鑒定及室內(nèi)致病力測(cè)定.pdf

1、綠僵菌和白僵菌已廣泛運(yùn)用于害蟲(chóng)生物防治中,且被開(kāi)發(fā)成不同劑型的高效真菌殺蟲(chóng)劑。目前防治蝗蟲(chóng)的殺蟲(chóng)劑較多,但是真正有效的殺蝗真菌殺蟲(chóng)劑仍然寥寥無(wú)幾。因此篩選高毒殺蝗的昆蟲(chóng)病原真菌菌株,可為蝗蟲(chóng)的生物防治奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本論文首先采用DGGE方法篩出不同基因型菌株,再進(jìn)行EF序列的擴(kuò)增和測(cè)序,通過(guò)比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),將各菌株準(zhǔn)確鑒定。然后在菌株室內(nèi)致病力的測(cè)定研究中主要采用浸蟲(chóng)法和餌劑喂食法來(lái)確定致病力較強(qiáng)的菌株。最后通過(guò)對(duì)高致病力菌株部

2、分生物學(xué)特性測(cè)定,為篩選出生產(chǎn)性狀良好的菌株提供必要數(shù)據(jù)?，F(xiàn)將主要結(jié)果陳述如下:
　　1、菌株的分子鑒定。
　　(1)球孢白僵菌菌株DGGE初篩。通過(guò)DGGE圖譜分析,結(jié)果顯示:檢測(cè)的27株球孢白僵菌共有6個(gè)基因型,分別為基因型A:Bb854,基因型B:Bb1028、Bb6、Bb860、Bb125,基因型C:Bb292、Bb654、Bb1179、Bb2270、Bb321、Bb322、Bb458、Bb859、Bb1372、Bb

3、1843、Bb2153、Bb2157、Bb2248、Bb2250、Bb2251,基因型D:Bb1519、Bb2253、Bb1906、Bb1975,基因型E:Bb1062、Bb2268,基因型F:Bb324。
　　(2)菌株EF序列測(cè)定、比對(duì)及分子鑒定。從6個(gè)基因型中各選擇1株球孢白僵菌,結(jié)合初步形態(tài)學(xué)鑒定為其他種的4株菌株Vl325、Ic449、Bbr91、Ma63共10株,分別提取基因組DNA,以983F、2218R為引物進(jìn)行P

4、CR擴(kuò)增,測(cè)序。在GenBank上進(jìn)行Blast比對(duì),同源性比對(duì)結(jié)果表明:6個(gè)基因型的菌株之間的序列均有一定差異,差異在99％以?xún)?nèi),但都和球孢白僵菌的模式菌株近似,序列差異在99-100%之間。通過(guò)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,結(jié)果表明:通過(guò)DGGE研究的6個(gè)基因型共27株菌株均可鑒定為球孢白僵菌Beauveriabassiana。其他4株非球孢白僵菌的蟲(chóng)生真菌菌株Vl325、Ic449、Bbr91和Ma63分別鑒定為刀孢蠟蚧菌Lecani

5、cilliumpsalliotae、環(huán)鏈棒束孢Isariacateniannulata,布氏白僵菌Beauveriabrongniartii、蝗綠僵菌Metarhiziumacridum。將這些已明確分類(lèi)地位的菌株,再結(jié)合它們的產(chǎn)孢特點(diǎn),最終確定以下菌株進(jìn)行室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn):Bb6、Bb860、Bb292、Bb654、Bb1179、Bb2270、Bb1519、Bb1906、Bb2253、Bbr91、Ma63。
　　2、室內(nèi)致病力測(cè)定。

6、
　　(1)蝗蟲(chóng)室內(nèi)飼養(yǎng)?；嚷言?0℃,相對(duì)濕度50~75%,光照12h的孵化天數(shù)為6~12d,結(jié)果表明:蝗卵孵化率在59.0~71.2%之間,其平均孵化率達(dá)到了65.0%?；闰镌?5~30℃,濕度30~50%,光照12~16h,結(jié)果表明:蛻皮天數(shù)為7~8d。從蝗卵孵化到我們所需要的3齡蝗蝻,共需27-36天。
　　(2)室內(nèi)致病力測(cè)定。在室內(nèi)用浸蟲(chóng)方法測(cè)定了11株菌株對(duì)東亞飛蝗3齡蝗蝻的致病力,初步篩選出死亡率較高的4株球

7、孢白僵菌和1株金龜子綠僵菌,結(jié)果顯示:校正死亡率較高分別為100%、93.3%、90%、86.7%、83.3%,致病力順序?yàn)锽b860>Ma63>Bb1906>Bb2270>Bb1519,它們LT50分別為3.04d、4.17d、4.37d、4.50d、5.76d。然后采取浸蟲(chóng)和喂食餌劑的方法,對(duì)初步篩選出的5株菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。結(jié)果表明:喂食餌劑的情況下,Ma63、Bb860、Bb2270、Bb1906對(duì)3齡蝗蝻的死亡率最高,LT5

8、0最短分別為4.81d、4.37d、5.00d、5.94d。采用浸蟲(chóng)方法的情況下,菌株致死中濃度LC50的順序依次為Bb860

9、63、Bb1519的校正死亡率依次為75.9%、72.4%、69%、69%、55.2%,致死中時(shí)依次為6.77d、7.32d、7.45d、7.75d、9.44d。25℃下菌株Bb860、Ma63、Bb1906、Bb2270、Bb1519的校正死亡率依次為100%、100%、89.7%、89.7%、82.8%,致死中時(shí)依次為3.13d、4.10d、4.53d、4.39d、5.87d。
　　3、高致病力菌株的生物學(xué)特性
　　通過(guò)

10、對(duì)Ma63、Bb860、Bb1906、Bb2270四株菌株的菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率及生長(zhǎng)速度幾方面的研究,進(jìn)一步了解菌株的生物學(xué)特性。研究結(jié)果表明:Bb860、Bb1906和Bb2270均菌落表面疏松、絨毛狀,孢子近球形,單細(xì)胞,大小在1.5~2.8×1.5~2.4μm范圍,Bb2270呈淡黃色,且背面黃棕色,而B(niǎo)b860、Bb1906菌落白色,背面均為淡黃色。菌株Ma63為緊密、絨毛狀,孢子圓柱形,兩端頓圓,單細(xì)胞,3

11、.8~5.3×2.4~3.3μm,正面黃綠色,背面橄欖色。菌株產(chǎn)孢量測(cè)定結(jié)果顯示:Bb860>Bb2270>Ma63>Bb1906,依次為2.8×107個(gè)/cm2、2.3×107個(gè)/cm2、2.0×107個(gè)/cm2、1.3×107個(gè)/cm2;其中孢子萌發(fā)率分別為98.0%、96.7%、93.7%、96.0%;Bb860、Ma63、Bb1906、Bb2270菌落在25℃SDAY培養(yǎng)基上平均每天生長(zhǎng)量分別為18.36mm、14.94mm、1