轉(zhuǎn)綠僵菌幾丁質(zhì)酶基因木霉菌對鱗翅目類昆蟲中腸細(xì)胞影響分子機(jī)理.pdf

1、木霉菌（Trichoderma sp.）是國際上公認(rèn)的生物防治微生物，在植物真菌病害的生物防治中具有廣泛的應(yīng)用。木霉菌生防作用的主要機(jī)制之一是產(chǎn)生一系列的細(xì)胞壁降解酶（Cell-wall Degrading Enzymes,CWDEs）降解植物病原真菌的細(xì)胞壁，促進(jìn)木霉菌對病原真菌的重寄生作用,其中幾丁質(zhì)酶是主要的降解酶類之一。無論是植物病原真菌的細(xì)胞壁，還是昆蟲體壁及圍食膜，幾丁質(zhì)都為重要的組成成分。因此，通過基因工程方法，豐富木霉菌

2、幾丁質(zhì)酶譜、提高其活性，對于協(xié)同防治在同時空發(fā)生的植物病蟲害具有重要理論和應(yīng)用價值。本研究以靶標(biāo)害蟲亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis(Guenée)）為研究對象，分析了轉(zhuǎn)綠僵菌（Metarhizium anisopliae）幾丁質(zhì)酶基因（chit42）木霉菌工程菌對亞洲玉米螟的殺蟲活性，研究了轉(zhuǎn)基因木霉菌對亞洲玉米螟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)和中腸微生態(tài)種群結(jié)構(gòu)的影響，為篩選轉(zhuǎn)chit42基因木霉工程菌作用玉米螟中腸細(xì)胞的靶標(biāo)、

3、揭示殺蟲機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。
　　為了明確轉(zhuǎn)chit42基因木霉菌對非靶標(biāo)昆蟲的影響，以鱗翅目模式昆蟲家蠶（Bombyx mori）為研究對象，研究了家蠶應(yīng)答轉(zhuǎn)基因木霉菌對中腸蛋白質(zhì)組學(xué)變化，明確差異表達(dá)蛋白與家蠶應(yīng)答木霉菌脅迫的關(guān)系，為鑒定轉(zhuǎn)基因木霉菌對鱗翅目類昆蟲的作用靶標(biāo)以及為轉(zhuǎn)基因木霉菌生物安全性評價提供理論依據(jù)。
　　主要研究內(nèi)容如下：
　　1、轉(zhuǎn)綠僵菌chit42基因木霉菌工程菌的構(gòu)建及功能分析
　　同

4、源克隆獲得金龜子綠僵菌（M.anisopliae）CY1幾丁質(zhì)酶基因chit42，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)（ATMT）的轉(zhuǎn)化方法將綠僵菌chit42基因在木霉菌中過表達(dá)，RT-PCR測定了外源基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，篩選幾丁質(zhì)酶酶活最高的木霉菌轉(zhuǎn)化子TMC42-11，測定了TMC42-11轉(zhuǎn)化子的幾丁質(zhì)酶發(fā)酵液和孢懸液對亞洲玉米螟的校正死亡率，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵液的殺蟲效果要高于孢懸液，與野生康寧木霉菌（Trichoderma koningi）T3

5、0相比，轉(zhuǎn)基因木霉菌對玉米螟的校正死亡率提高6倍，同源克隆獲得玉米螟中腸保幼二醇激酶基因（jhdk）、氨肽酶N基因（apn）及類細(xì)胞色素P450基因，轉(zhuǎn)基因木霉菌處理后，三種基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)受到抑制；外源基因的導(dǎo)入未影響木霉菌對輪枝鐮孢菌（Fusarium verticilloides）的抑制。在綠僵菌chit42基因去掉其終止密碼子后在基因C端融合了一段eGFP序列，同時綠僵菌chit42基因前18個氨基酸的信號肽序列被替換成木霉

6、菌chit42基因的信號肽序列，過表達(dá)框通過ATMT技術(shù)導(dǎo)入木霉菌基因組中，熒光顯微鏡觀察菌絲體綠色熒光蛋白的表達(dá)，并利用RT-PCR技術(shù)驗證外源導(dǎo)入eGFP的表達(dá)。
　　2、融合幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)結(jié)合域（chitin-binding domain,chBD）綠僵菌chit42基因木霉菌工程菌構(gòu)建及功能分析
　　選擇的5種不同來源的chBD為：家蠶幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)結(jié)合域（BmchBD）、云杉蚜蟲（Choristoneura fum

7、iferana）幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)結(jié)合域（CfchBD）、果蠅（Drosophila melanogaster）幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)結(jié)合域（DmchBD）、苦瓜（Momordica charantia）幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)結(jié)合域（McchBD）及環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)結(jié)合域（BcchBD）。將這5種chBD與去掉終止密碼子的綠僵菌chit42基因在C端融合，構(gòu)建融合幾丁質(zhì)酶過表達(dá)框，通過ATMT技術(shù)將融合幾丁

8、質(zhì)酶過表達(dá)框?qū)肽久咕蚪M中，RT-PCR驗證融合幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)，幾丁質(zhì)結(jié)合域融合后均能夠提高木霉菌轉(zhuǎn)化子的幾丁質(zhì)酶酶活，其中酶活最高的為chit42基因融合McchBD的木霉菌轉(zhuǎn)化子Mc4，Mc4幾丁質(zhì)酶發(fā)酵液處理喂食人工飼料后，玉米螟死亡率較未融合轉(zhuǎn)化子Mchit3提高10％，較野生株T30提高了30%；轉(zhuǎn)化子處理喂食48h后，玉米螟中腸微絨毛及杯狀細(xì)胞微絨毛出現(xiàn)脫落；融合幾丁質(zhì)酶基因木霉菌轉(zhuǎn)化子Mc4對輪枝鐮孢菌和立枯絲核菌

9、（Rhizoctonia solani）的抑制性高于非融合幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化子及野生菌；同源克隆獲得玉米螟中腸幾丁質(zhì)酶基因，喂食Mc4處理、Mchit3處理及T30處理人工飼料后，玉米螟中腸幾丁質(zhì)酶基因在RNA水平上的表達(dá)未表現(xiàn)顯著差異。離體條件下在玉米果穗上接種禾谷鐮孢菌和玉米螟幼蟲，與野生株T30相比，工程株Mc4表現(xiàn)出了更好的防治效果。
　　3、木霉菌工程菌對亞洲玉米螟中腸微生態(tài)的影響及與玉米螟致死率的關(guān)系
　　昆蟲中腸

10、微生態(tài)平衡對于昆蟲正常生長發(fā)育至關(guān)重要。研究轉(zhuǎn)基因木霉菌對玉米螟中腸微生態(tài)的影響，對于揭示轉(zhuǎn)外源chit42基因木霉菌殺玉米螟的微生態(tài)學(xué)機(jī)理、篩選新的作用靶標(biāo)具有重要意義。結(jié)果表明，腸球菌（Enterococcus）、蒼白桿菌（Ochrobactrum）及無色桿菌（Achromobacter）為玉米螟中腸優(yōu)勢菌群，分屬于變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），其他非優(yōu)勢菌群包括：土壤桿菌屬（Agrob

11、acterium）及鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）。喂食轉(zhuǎn)chit42基因木霉工程菌處理的人工飼料后，玉米螟中腸微生態(tài)組成發(fā)生顯著變化，主要表現(xiàn)在腸球菌數(shù)量的上升，增加的腸球菌占據(jù)了中腸的生態(tài)位使得蒼白桿菌數(shù)量顯著下降，另外，轉(zhuǎn)chit42基因木霉菌處理后玉米螟中腸微生態(tài)多樣性指數(shù)包括香農(nóng)指數(shù)（Shannon-Wiener(H)）和辛普森指數(shù)（Simpson(1-D)）是最低的。為了明確腸球菌數(shù)量上升對玉米螟死亡率的影

12、響，利用腸球菌篩選培養(yǎng)基將中腸腸球菌進(jìn)行了分離鑒定，制備含腸球菌人工飼料，喂食或者注射玉米螟2齡幼蟲，結(jié)果表明：中腸內(nèi)腸球菌數(shù)量的增加與玉米螟死亡率上升呈正相關(guān)。
　　4、家蠶應(yīng)答轉(zhuǎn)chit42木霉菌工程菌脅迫中腸蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　為了分析轉(zhuǎn)chit42木霉菌對非靶標(biāo)昆蟲的潛在影響，我們以鱗翅目模式昆蟲家蠶作為研究對象，分析了家蠶應(yīng)答轉(zhuǎn)chit42基因木霉菌脅迫中腸蛋白組學(xué)變化。通過PDQuest軟件分析，共找到29個蛋白

13、表現(xiàn)穩(wěn)定的差異表達(dá)變化，并結(jié)合MALDI-TOF-TOF MS方法對蛋白進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，這些差異表達(dá)蛋白大多與能量代謝、蛋白合成、生長發(fā)育調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及抗逆脅迫相關(guān)。與對照相比，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶sigma2（GSTs2）為上調(diào)表達(dá)，已有研究表明，該蛋白的主要功能是催化谷胱甘肽的巰基與有毒親電子類物質(zhì)發(fā)生軛合反應(yīng)，以達(dá)到解毒的目的，進(jìn)一步的工作我們將圍繞驗證谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶sigma2的功能展開。本研究將有助于從組學(xué)角度認(rèn)

14、知轉(zhuǎn)基因木霉工程菌對鱗翅目昆蟲的影響，為評價轉(zhuǎn)基因木霉菌生物安全性提供新方法，同時對篩選鱗翅目害蟲作用靶標(biāo)也具有重要價值。
　　5、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶sigma2（GSTs2）基因功能分析
　　根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，在NCBI網(wǎng)站上搜索GSTs2基因的cDNA序列，構(gòu)建GSTs2基因RNA干擾（RNAi）載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HT115（DE3）感受態(tài)誘導(dǎo)GSTs2基因的dsRNA，將純化后的dsRNA注射家蠶體腔，QRT-PCR

15、檢測干擾后家蠶GSTs2基因在RNA水平上的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，注射基因dsRNA后1d及3d均導(dǎo)致了GSTs2基因表達(dá)量下降的情況，而注射GFP基因dsRNA處理和注射ddH2O處理均未導(dǎo)致GSTs2基因表達(dá)量下降，說明GSTs2基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受到了干擾。喂食含木霉菌工程菌處理的桑葉后，測定了GSTs2基因干擾后1d及3d家蠶的體重，結(jié)果顯示，與未注射家蠶、注射ddH2O處理及注射GFP基因dsRNA處理相比，注射GSTs2基

16、因dsRNA處理后家蠶生長受到顯著影響。雖然注射ddH2O處理及注射GFP基因dsRNA處理也對家蠶生長受到影響，但是與注射GSTs2基因dsRNA處理相比，家蠶生長抑制更加明顯，該結(jié)果表明，GSTs2基因確實與家蠶應(yīng)答木霉菌脅迫相關(guān)。分析了GSTs2基因干擾對GST其他家族基因表達(dá)的影響，其中GSTo2基因表達(dá)量顯著增加，推測該基因也與家蠶應(yīng)答木霉菌脅迫相關(guān)。
　　綜上所述，本研究明確了轉(zhuǎn)綠僵菌chit42基因木霉菌工程菌殺蟲活