殼聚糖季銨鹽對戊型肝炎病毒多肽疫苗免疫效果影響的研究.pdf

1、隨著科技水平的不斷發(fā)展，現(xiàn)代生物技術(shù)研制出的各種有效的疫苗，對各種傳染病的預(yù)防和控制已經(jīng)達(dá)到了顯著效果。免疫佐劑(immunoadjuvant)作為疫苗的添加劑，對疫苗的免疫預(yù)防作用有效地發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。免疫佐劑是指先于抗原或與抗原同時(shí)應(yīng)用，能非特異地改變或增強(qiáng)機(jī)體對抗原的特異性免疫應(yīng)答，以及能增強(qiáng)相應(yīng)抗原的免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)。佐劑對疫苗免疫效應(yīng)的增強(qiáng)作用主要表現(xiàn)在:能在機(jī)體內(nèi)緩慢釋放抗原物質(zhì)以延長疫苗與免疫細(xì)胞的

2、作用時(shí)間;能通過增加抗原物質(zhì)的表面積使之易于被巨噬細(xì)胞識別和吞噬;刺激淋巴細(xì)胞的分裂和漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體;提高機(jī)體抗體滴度;能夠改變抗體的類型以及增強(qiáng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。傳統(tǒng)的免疫佐劑種類繁多，按免疫原性可分為具備免疫原性的佐劑和不具備免疫原性的佐劑，按化學(xué)性質(zhì)可分為無機(jī)佐劑、有機(jī)佐劑、合成佐劑、油劑四種。隨著新型疫苗的不斷發(fā)展，對免疫佐劑的各方面的要求也提高了，傳統(tǒng)的免疫佐劑因其安全性、免疫刺激效果等問題逐漸受到質(zhì)疑和淘汰，新的免疫佐劑的研究

3、越來越受到廣泛關(guān)注。
　　殼聚糖(chitosan，CS)是由自然界中的甲殼素經(jīng)脫乙酰作用得到的，是天然多糖中帶正電的高分子物質(zhì)，具有化學(xué)穩(wěn)定性良好、無毒無害、生物相容性優(yōu)良和代謝產(chǎn)物無毒并能被生物體完全吸收等優(yōu)點(diǎn)。但CS在水中的溶解度非常低，廣泛應(yīng)用受到了一定限制。水溶性殼聚糖衍生物的制備解決了CS溶解性問題，具有更廣泛的研究和應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室按照文獻(xiàn)以3-氯-2-羥丙基-三甲基氯化銨（3-chloro-2-hydroxypr

4、opyl trimethyl ammonium chloride，CTA）為化學(xué)改性劑對CS進(jìn)行接枝改性制備的殼聚糖季銨鹽——3-氯-2-羥丙基三甲基殼聚糖（3-chlorine-2-hydroxypropyl trimethyl chitosan，HTCC）接枝度高達(dá)71.4％，溶解性高達(dá)70.1mg/ml。本實(shí)驗(yàn)以HTCC作為免疫佐劑，表達(dá)的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)重組蛋白作為多肽疫苗，免疫接種小鼠

5、，檢測免疫指標(biāo)以評價(jià)HTCC作為免疫佐劑的潛質(zhì)。本研究主要內(nèi)容包括以下幾方面:
　　1.HEV重組蛋白的表達(dá)、純化、復(fù)性和鑒定
　　將包含HEV ORF2基因片段（394aa-660aa）和HEV ORF3全基因的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ORF23在大腸桿菌中進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),37℃，200rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，分別取培養(yǎng)液、超聲上清和沉淀樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，結(jié)果

6、顯示HEV重組蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)。超聲沉淀經(jīng)低濃度尿素溶液洗滌、高濃度尿素溶解、Ni-NTAHis·Bind(@) Resins純化、梯度濃度的尿素復(fù)性液透析復(fù)性、聚乙二醇濃縮獲得純化的重組蛋白。分別取蛋白粗純化樣品、Ni-NTA His·Bind(@) Resins純化樣品以及復(fù)性濃縮后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析得出:低濃度尿素洗滌效果良好，去除了包涵體中大量的雜蛋白;Ni-NTA His·Bind(@) Resin

7、s純化效果顯著，得到了高純度的目的蛋白;純化蛋白復(fù)性和濃縮后蛋白條帶清晰度高、條帶單一表明獲得了一定純度和濃度的HEV重組蛋白。復(fù)性濃縮的蛋白經(jīng)Western blot分析表明其免疫原性良好。復(fù)性濃縮后的HEV重組蛋白作為多肽疫苗免疫小鼠。
　　2.免疫效果的研究
　　50只Balb/c雌性小鼠隨機(jī)分為5組:①加HTCC佐劑組(1.5mg/ml HTCC+0.2mg/ml HEV重組蛋白);②陽性組（弗氏佐劑+0.2mg/m

8、l HEV重組蛋白）;③不加佐劑組（0.2mg/ml HEV重組蛋白）;④HTCC(1.5mg/ml)組;⑤PBS組。各組小鼠后腿肌肉注射200μl/只·次，間隔3周加強(qiáng)免疫一次，共免疫2次。在初次免疫2周、加強(qiáng)免疫2周和5周三個(gè)免疫階段，5組小鼠尾部靜脈取血分離血清，采用ELISA檢測抗HEV-IgG抗體水平。末次免疫5周后，四色流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫小鼠全血中CD4+、CD8+、IFN-γ+和IL-4+細(xì)胞的百分率;MTS法檢測小鼠脾臟

9、T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。
　　加HTCC佐劑組在三個(gè)免疫階段中血清中的抗HEV-IgG抗體均極顯著高于不加佐劑組(P＜0.01)，其小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的蛋白刺激指數(shù)也顯著高于不加佐劑組（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明各組間的CD4+細(xì)胞百分率無顯著差異，加HTCC佐劑組的IFN-γ+細(xì)胞百分率顯著高于不加佐劑組和兩個(gè)陰性組(P＜0.05)，其IL-4+細(xì)胞百分率顯著低于不加佐劑組和兩個(gè)陰性組（P＜0.05）。
　　綜上所述