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文檔簡介
1、戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的急性病毒性肝炎,主要經(jīng)胃腸道傳播。我國先后曾發(fā)生多次HE流行,1986-1988年新疆南部因水源污染發(fā)生過世界上規(guī)模最大的HE暴發(fā)流行,約有12萬人發(fā)病。近年來我國HE的發(fā)病率和死亡率早逐年上升趨勢,己被列為因HE發(fā)病和死亡而引起的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)最為嚴(yán)重的國家之一。為了有效控制HE,HE疫苗已被世界衛(wèi)生組織推薦為21世紀(jì)最優(yōu)先發(fā)展的疫苗
2、之一。 HEV主要分成4個基因型,研究報道顯示我國主要以4型為主。目前HEV尚無成熟的組織培養(yǎng)體系和經(jīng)濟(jì)、合適的小動物模型。難以制備傳統(tǒng)的滅活疫苗或減毒活疫苗。因此,HE疫苗的研究主要集中于基因工程疫苗和DNA疫苗上。但迄今為止,尚無HE疫苗批準(zhǔn)上市。合適的免疫原對疫苗的制備具有相當(dāng)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究將HEV的中和抗原表位定位于HEV ORF2編碼蛋白C端的第452-617位氨基酸之間。在此基礎(chǔ)上,我們發(fā)現(xiàn)第4基因型
3、HEV p179可以在原核系統(tǒng)中獲得高效、可溶性表達(dá)。經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)表明,該蛋白吸附氫氧化鋁佐劑后可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的抗-HEV,免疫血清在體外可以中和HEV對細(xì)胞的感染。因此,HEVp179可以用作HE疫苗的研究。 最好的疫苗評價途徑就是接種易感動物,并進(jìn)行病毒攻擊,觀測其保護(hù)效果。本研究中我們選用了目前最常用于實(shí)驗(yàn)性感染HEV的恒河猴作為實(shí)驗(yàn)動物,將制備的重組蛋白HEV p179免疫恒河猴,進(jìn)行HEV攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn),觀察HE候選
4、疫苗p179的保護(hù)效果。 本研究分為以下二個部分: 一、戊型肝炎重組疫苗恒河猴免疫保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究 9只恒河猴(M1~9)隨機(jī)分為對照組(M1、M2、M3)和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組又分為低劑量組(M4、M5、M6,10μg/只)和高劑量組(M7、M8、M9,20μg/只)。HE候選疫苗p179經(jīng)鋁佐劑(1g/L)吸附后,實(shí)驗(yàn)組每只左側(cè)三角肌注射1mL相應(yīng)劑量抗原,對照組每只注射1mL鋁佐劑,免疫程序?yàn)?、4、8周。末次免疫
5、后4周,對照組和實(shí)驗(yàn)組每只猴均靜脈注射1mL 10%HE急性期患者糞便懸液(HEV第4基因型,PCR滴度為107/mL)進(jìn)行攻擊。對照組攻毒后3只猴中2只也現(xiàn)短暫厭食、腹瀉,伴精神萎靡等癥狀:攻毒后第3天3只猴均從糞便懸液中檢測到HEV RNA,持續(xù)5周以上,最長持續(xù)7周;攻毒后1周2只猴ALT升高,峰值達(dá)150 U~184 U,持續(xù)3~4周;攻毒后1周血清抗-HEV IgM陽轉(zhuǎn),2周后3只猴抗-HEV IgG陽轉(zhuǎn),第4周達(dá)到峰值。實(shí)驗(yàn)
6、組6只猴在初次免疫后2周抗-HEV IgG陽轉(zhuǎn),第4~5周達(dá)到峰值;免疫及攻毒后6只猴均無異常癥狀,ALT均正常;高劑量組M7攻毒后1周于糞便中檢測到HEV RNA,持續(xù)3周,其余5只猴糞便HEV RNA始終陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HEV p179重組疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用。 二、ELISA定量檢測猴血清抗-HEV IgG工作參比品的制備及應(yīng)用 通過上述研究,我們推測HEV p179的免疫保護(hù)作用可能與其誘導(dǎo)的抗體滴度的
7、高低有關(guān)。為了方便抗體的定量檢測和不同個體之間抗體滴度的相互比較,我們進(jìn)一步開展了猴血清抗-HEV IgG工作參比品的制備和應(yīng)用的研究。 首先取不同猴不同時期的HEV p179免疫血清加50%甘油混合之后分裝保存,將ELISA檢測過程中的所用試劑以及程序標(biāo)準(zhǔn)化,以不同包被批次酶標(biāo)條在不同時間檢測該血清的抗-HEV IgG,經(jīng)仔細(xì)鑒定和定量后作為工作參比血清。處于線性范圍的血清稀釋度為:1:400、1:800、1:1600、1:3
8、200、1:6400。將線性范圍內(nèi)的中間點(diǎn),即工作參比血清作1:1600稀釋時的抗體含量定為1AU/mL(arbitrary unit/mL)。在線性范圍內(nèi)各稀釋度OD值與其抗體含量的對數(shù)呈線性正相關(guān)(R2=0.9955)。 根據(jù)工作參比品標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣本的抗體含量。12周后,感染免疫組3只猴的抗體含量分別為803AU/mL、3610AU/mL、1278AU/mL;低劑量組3只猴的抗體含量分別為2147AU/mL、2304AU/
9、mL、3442AU/mL;高劑量組3只猴的抗體含鼉分別為236AU/mL、1863AU/mL、2476AU/mL。結(jié)果表明,高劑量組中抗體含量為236AU/mL的猴M7在上述攻擊試驗(yàn)中出現(xiàn)隱性感染,表現(xiàn)為糞便短暫排毒,與其對疫苗反應(yīng)性的個體差異有關(guān)。 綜上所述,本研究得出以下結(jié)論,HE候選疫苗p179免疫恒河猴后,中和保護(hù)性抗體迅速升高,可以中和HEV的感染,保護(hù)恒河猴免受HEV野毒株的攻擊。成功制備定量檢測猴血清抗-HEV I
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