緩釋載藥聚乳酸凝膠預防氣管纖維組織增生的實驗研究.pdf

1、研究背景
　　 喉氣管狹窄(laryngotrachealstenosis，LTS)最常見的病因是機械性外傷和醫(yī)源性損傷，機械性外傷包括喉氣管外傷后的軟骨骨折或者氣道挫裂和移位變形，醫(yī)源性損傷包括氣管插管、氣管切開、喉部放療及喉部手術等因素。喉氣管狹窄以聲門下狹窄（SGS，subglotticstenosis）和氣管狹窄（TS，trachealstenosis）最常見，目前治療方法包括手術治療、激光治療、支架擴張及藥物治療等。常

2、用的手術方法包括氣管重建術、環(huán)狀軟骨切除術、激光手術包括CO2激光、Nd:YAG激光等方法。對于預防喉氣管狹窄手術后再狹窄及喉氣管惡性腫瘤阻塞需要支架的支撐，但是目前可行的支架都不能順應氣道的解剖結構而導致氣道的損傷，對喉氣管粘膜刺激引發(fā)的咳嗽，支架移位、脫落，支架上下端部位肉芽的生長及有可能拔管后再次發(fā)生喉氣管狹窄等一些常見并發(fā)癥尚未得到滿意的解決。對于良性的喉氣管狹窄，半年至1年后拔出支撐管后還有因纖維組織增生而再次狹窄的可能，肉芽

3、組織的形成是喉狹窄支架置入最常見的并發(fā)癥。近年來絲裂霉素C(mitomycinC，MMC)抗腫瘤、抗瘢痕形成、減少肉芽組織增生和防止組織粘連的作用得到了公認，被廣泛應用于臨床相關治療中。
　　 MMC最早發(fā)現(xiàn)于1956年，是從頭狀鏈霉菌培養(yǎng)液中分離提取的一種廣譜抗腫瘤抗生素。作為一種廣譜抗腫瘤藥物，MMC被用作系統(tǒng)化療藥，應用于乳腺、肺、胰腺及結腸直腸癌的治療中。MMC具有抗腫瘤和抑制增殖的雙重作用，作為一種烷化劑，其主要作用機

4、制是與DNA的雙螺旋形成交聯(lián)，破壞DNA的結構和功能，抑制增殖期DNA的復制，對增殖期中的細胞均有殺傷作用，同時也作用于靜止期的細胞，因而可用來阻止手術區(qū)的血管再生和瘢痕形成。研究表明，MMC在體內和體外均能抑制成纖維細胞增生，從而減少各種細胞外基質成分合成。MMC可使體外培養(yǎng)的成纖維細胞中cyclinD1的表達下調，caspase-3的表達上調。cyclinD1是細胞周期中G1期的關鍵調控蛋白，其下調將阻止細胞由G1期進入S期，從而抑

5、制細胞增殖。caspase-3被稱為死亡蛋白酶，其上調將激活凋亡級聯(lián)反應，使細胞進入不可逆的凋亡過程，誘導細胞凋亡。MMC可能通過上述途徑抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，使成纖維細胞減少，預防瘢痕產生。在預防聲帶術后的粘連及氣管手術后的狹窄中，絲裂霉素可能也通過這些途徑發(fā)揮作用。
　　 局部應用絲裂霉素聯(lián)合氣道置入支架治療是一種有前景的方法。在耳鼻咽喉頭頸外科中，絲裂霉素C對預防喉粘連和鼻腔粘連有一定療效，但所有研究均是一次性用藥，

6、把含有絲裂霉素C的棉片在創(chuàng)面敷貼4-5分鐘，不能完全解決粘連問題。國外報道用聚乳酸聚乙醇酸(PolyL-lactide-co-glycolide，PLGA)納米微?？梢宰鳛閯游锖聿康木徛屗庉d體，該實驗中將載有德克薩斯紅葡聚糖、肝細胞生長因子及牛血清白蛋白的PLGA納米微粒注射到小鼠聲帶，體外實驗中載有這三種不同物質的PLGA均可釋放12d-14d天以上，紅葡聚糖在體內持續(xù)釋放達1周，肝細胞生長因子在體外仍可以減少TGF-β誘導3T3型

7、成纖維細胞中膠原的生長，說明了PLGA載藥納米微?？梢蚤L期釋放藥物并且可以保持藥物的生物活性。
　　 聚乳酸凝膠為可注射用生物降解性材料，其生物組織相容性好。聚乳酸凝膠在冷藏條件下為液態(tài)，常溫下為膠體狀，可攜帶藥物，在喉氣管疾病應用方面，可作為良好的注射用藥物緩釋載體。溫敏型聚乳酸凝膠注射到體內后，在體溫作用下原位凝固，可將其作為藥物釋放載體，把所需劑量的藥物與聚乳酸凝膠混合后注射到患病部位，可迅速形成凝膠。這種原位形成的水凝膠

8、可以和周圍組織牢固的結合，可控制在特定部位形成凝膠，在病灶處精確地釋放包裹的藥物，有效地控制了凝膠中藥物的釋放范圍，減輕全身的不良反應。
　　 地塞米松磷酸鈉（Dexamethasonesodiumphosphate，DSP）為糖皮質激素類用藥，具有明顯抗炎作用，其對各種原因（物理、化學、生物、免疫等）引起炎癥都有很強的抗炎作用，減輕炎癥早期的滲出、水腫、毛細血管擴張、白細胞浸潤及吞噬反應。在炎癥后期可抑制毛細血管和纖維母細胞的

9、增生，延緩肉芽組織生成，防止粘連及瘢痕形成。其價格便宜，局部用藥不良反應少，可抑制纖維組織增生，本實驗將聚乳酸凝膠作為MMC、DSP的緩釋載體并用于喉氣管外壁纖維組織增生的動物模型，研究其對氣管纖維組織增生的抑制作用，為未來研究PLGA支架涂層藥物緩釋載體對喉氣管狹窄的治療提供實驗基礎。
　　 目的
　　 探討載MMC與DSP的聚乳酸凝膠在體內外的緩釋情況及對氣管纖維組織增生的抑制作用。
　　 方法
　　

10、 在體外緩釋實驗中，將聚乳酸凝膠加入雙蒸水，于4℃冰箱中放置24h以上，直至完全溶解得到澄明溶液，攪拌下加入MMC、DSP攪拌10min。37℃水浴放置5min，制成原位凝膠。取1mg/ml的MMC聚乳酸凝膠1ml及2mg/ml的DSP聚乳酸凝膠1ml分別置于10mlPH為7.4PBS中，在37℃恒溫搖床中，以120r/min的速度持續(xù)搖蕩。分別于1、4、6、8、12h，1、3、5、7、14、21、28、35d取出樣本200μl并加入等

11、量的新鮮PBS溶液。各樣本通過0.45μm微孔濾膜過濾，測定釋放介質中MMC及DSP的含量，藥物的累積濃度通過紫外分光光度法測定。通過觀察各時間點留取的浸出液分別測出在365nm及242nm處的紫外分光光度值，實驗重復3次。
　　 在體內緩釋試驗中，通過喉氣管外壁損傷建立纖維組織增生的動物模型。將42只新西蘭大白兔按照完全隨機的方法分成7組后進行氣管外壁刮傷，將0.2ml載有不同的藥物劑量的聚乳酸凝膠與明膠海綿混勻后置于損傷后的

12、氣管外壁，并用半圓形的硅膠管固定。實驗組包括載MMC組3組(0.1mg，0.2mg，0.4mg)、載藥DSP組3組(1mg，2mg，3mg)和空白對照組1組。分別于術后1、3、7、10、14、21d從0.4mgMMC組耳緣靜脈抽血1ml，用質譜方法測量動物體內藥物釋放濃度。術后1、7、14d從耳緣靜脈抽血1.5ml測定血常規(guī)觀察白細胞計數(shù)。術后4周通過空氣栓塞處死動物后取氣管外壁標本，標本經過福爾馬林固定，石蠟切片，HE染色，光學顯微鏡

13、下觀察纖維組織增生厚度。
　　 統(tǒng)計學方法:實驗數(shù)據(jù)通過SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，組間比較采用LSD(Least-significantDifference)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 藥物體外實驗發(fā)現(xiàn)1mgMMC緩釋時間可達35天以上，2mgDSP緩釋時間可達28天以上，DSP早期釋放相對較快，6hDSP累積釋放濃度達(31.5

14、1±2.31)％，28d時累積釋放濃度達(92.01±1.76)％，以后釋放逐漸緩慢，逐漸趨于平衡。MMC在21d之前釋放較緩慢，累積釋放濃度達(32.05±1.81)％，35d時累積釋放濃度達(84.28±3.06)％。
　　 在動物體內兩種藥物凝膠在術后4周尚未完全降解，各組氣管外壁纖維組織增生厚度如下:空白組:0.82±0.29mm;0.1mgMMC組:0.65±0.16mm;0.2mgMMC組:0.49±0.24mm;0

15、.4mgMMC組:0.17±0.09mm;1mgDSP組:0.31±0.33mm;2mgDSP組:0.18±0.13mm;3mgDSP組:0.14±0.13mm。通過One-WayANOVALSD檢驗，兩種藥物各劑量組（除0.1mgMMC組外）與對照組比較，纖維組織增生厚度差異具有統(tǒng)計學意義(F=9.482，P=0.000)，說明藥物（除0.1mgMMC組外）對氣管壁纖維組織增生有明顯抑制作用;在MMC凝膠不同劑量組中，0.4mgMMC

16、組與其他劑量組纖維組織增生厚度差異均有統(tǒng)計學意義(F=11.973,P=0.001)，0.4mgMMC纖維組織增生的平均厚度最小，說明0.4mgMMC為動物體內抑制纖維組織增生效果最好的最低劑量;在DSP不同劑量組中，總體差異無顯著統(tǒng)計學意義（F=0.988，P=0.395），1mgDSP為動物體內最大程度抑制氣管瘢痕形成的合適劑量;0.4mgMMC與DSP各組間抑制纖維組織增生的程度差異均無統(tǒng)計學意義(F=0.893,P=0.462)

17、。其中0.4mgMMC組，從第1～21天動物體內MMC血漿中平均濃度為(0.16±0.12)ng/ml，在第7天釋放濃度達到高峰，第10天以后藥物釋放逐漸趨于平衡。術后1、7、14d抽血觀察白細胞計數(shù)，白細胞計數(shù)分別為(9.03±1.57)×109/L、(9.85±1.63)×109/L、(10.17±3.11)×109/L，通過One-WayANOVALSD檢驗發(fā)現(xiàn)3組白細胞計數(shù)差別無顯著性統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明載有MMC的

18、聚乳酸凝膠對動物的骨髓無明顯抑制作用。
　　 結論
　　 MMC及DSP聚乳酸凝膠在動物體內及體外釋放時間均可長達4周以上。在新西蘭大白兔體內MMC抑制纖維增生的最合適劑量為0.4mg,DSP最合適劑量為1mg，MMC、DSP聚乳酸凝膠均可作為預防纖維組織增生的臨床用藥。本研究結果為未來研究生物可降解聚乳酸聚乙醇酸(PolyL-lactide-co-glycolide，PLGA)涂層藥物緩釋載體支架對喉氣管狹窄的治療提供