記憶提取誘發(fā)杏仁體基底外側(cè)核的蛋白降解在線索性恐懼記憶擦除過程中的作用.pdf

1、一、研究背景
　　經(jīng)典的巴甫洛夫恐懼記憶條件反射模型（Pavlovianfearconditioning）的建立是通過一個(gè)無害的刺激，即條件性刺激(conditionedstimulus,CS)，如聲音，光線，環(huán)境等和一個(gè)先天的厭惡性非條件刺激(unconditionedstimulus，US)如足底電擊建立條件反射來實(shí)現(xiàn)的。條件反射建立穩(wěn)定之后，如果給予動(dòng)物反復(fù)的CS刺激，又會(huì)使得動(dòng)物覺得偶聯(lián)的CS無害，導(dǎo)致恐懼記憶漸進(jìn)性減弱，

2、從而造成記憶的消退(extinction)。但消退不是永久性的，消退的記憶會(huì)被一些自發(fā)因素再次喚起，這提示消退可能并不是直接對原有記憶的修改，而是通過形成一個(gè)新的記憶來抑制原有的記憶的激活。這種對原有記憶的抑制是和消退訓(xùn)練時(shí)的時(shí)空環(huán)境以及動(dòng)物的感覺緊密相關(guān)的，人類和嚙齒類動(dòng)物相似，都會(huì)在三種普遍的情況下發(fā)生消退后的記憶的再度出現(xiàn)。這三種情況是:(1)更新(renewal)，當(dāng)CS在消退環(huán)境外的環(huán)境出現(xiàn)時(shí)會(huì)發(fā)生;(2)復(fù)原(reinsta

3、tement)，當(dāng)原始的US再次出現(xiàn)時(shí)發(fā)生;(3)自發(fā)恢復(fù)(spontaneousrecovery)，當(dāng)消退后經(jīng)歷一定時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)。當(dāng)前在臨床治療上，基于消退訓(xùn)練的暴露療法廣泛地應(yīng)用于許多病態(tài)記憶的治療中，例如創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合癥、恐懼癥等等。這些治療方法在某些方面是有效的，但是并不適用與任何人，部分患者會(huì)由于更新、復(fù)原或自發(fā)恢復(fù)而導(dǎo)致病情的復(fù)發(fā)。
　　以往的研究表明，記憶的再鞏固后會(huì)有一個(gè)記憶變的不穩(wěn)定的時(shí)間窗。近來的研究表明，將記

4、憶提取(retrieval)出來，并在提取后的時(shí)間窗內(nèi)進(jìn)行記憶的消退訓(xùn)練有擦除記憶的作用，從而抑制了原有記憶的喚起。也就是說，用之前和足底電擊偶聯(lián)在一起的CS將記憶提取出來（即retrieval），10min或1小時(shí)之后進(jìn)行消退訓(xùn)練，可以有效地擦除恐懼記憶的更新、復(fù)原和自發(fā)恢復(fù)（6小時(shí)以后則會(huì)失效）。這種記憶提取-消退模型是可以消除原有記憶復(fù)發(fā)的一個(gè)有效模型，而且已經(jīng)證明這種模型不僅在恐懼記憶中存在，在成癮記憶中也存在，并且擦除效果在嚙

5、齒類和人類身上都有效。然而這種記憶擦除模型具有一定的局限性:有研究報(bào)道在記憶鞏固完成一個(gè)月之后再用Retrieval+Extinction模型就無法擦除記憶;并且這種擦除模型限定條件較多，如果更改模型中的一些條件，則記憶擦除就有可能會(huì)失敗。因此，找到記憶擦除的機(jī)制，并針對介導(dǎo)記憶擦除的關(guān)鍵性位點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，將為我們對相關(guān)基本疾病的治療（如創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合癥等）的應(yīng)用大有裨益。
　　突觸在動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶過程中會(huì)發(fā)生一系列的形態(tài)學(xué)和功能上

6、的變化，這些變化是依賴與蛋白合成與蛋白降解的共同作用的。目前針對蛋白合成與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系研究的較為透徹，但對蛋白降解在學(xué)習(xí)記憶作用卻研究很少。真核細(xì)胞的蛋白降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的過程，泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasomesystem，UPS)在這個(gè)過程中扮演著重要的角色。有研究表明，在伏核核部(nucleusaccumbens，NAc)注射蛋白酶體抑制劑可以破壞可卡因獎(jiǎng)勵(lì)記憶的消退，但明確的關(guān)于蛋白降解是否參與線索

7、性條件性恐懼記憶中的聲音誘導(dǎo)的條件性恐懼記憶模型(Auditoryfearconditioning，AFC)的消退還沒有報(bào)道。此外，最新的研究表明，在環(huán)境誘導(dǎo)的條件性恐懼記憶模型中，海馬CA1腦區(qū)中的多泛素化水平會(huì)在記憶提取之后升高。聯(lián)系之前的研究，我們可以提出假設(shè)，是否記憶提取之后蛋白降解水平的升高介導(dǎo)了記憶的擦除過程？在這篇文章中，我們采用聲音誘導(dǎo)的條件性恐懼記憶模型研究了記憶擦除的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)在大鼠的杏仁體基底外側(cè)核(basol

8、ateralamygdala，BLA)中，蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白降解在記憶擦除中扮演著重要角色。
　　二、研究目的
　　研究蛋白降解在記憶擦除中的作用并初步探討其機(jī)制。
　　三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.在BLA注射蛋白酶體活性抑制劑βLac對AFC記憶消退的影響
　　在雙側(cè)BLA注射蛋白酶體的抑制劑βLac0.5hr后進(jìn)行消退訓(xùn)練，24小時(shí)后檢測LTM，評價(jià)其對大鼠AFC記憶消退的影響。與溶劑對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的

9、Freezing值與對照組無明顯差異。
　　2.βLac抑制retrieval對AFC記憶消退自發(fā)恢復(fù)的擦除
　　所有的動(dòng)物在經(jīng)歷三次CS-US偶聯(lián)刺激之后分為三組:retrieval后消退組（Ret組），注射βLac后retrieval并消退組（Ret+βLac組)以及noretrieval消退組（NoRet組）。三組注射溶劑或者βLac30min后進(jìn)行retrieval或者noretrieval訓(xùn)練，1hr之后對動(dòng)物進(jìn)行

10、消退訓(xùn)練，24小時(shí)后檢測LTM，在LTM測試兩周后檢測動(dòng)物的自發(fā)恢復(fù)情況。結(jié)果顯示，三組間的LTM和extinction結(jié)果均無差異(ANOVA，p＞0.1);和Ret組相比，NoRet組和Ret+βLac組自發(fā)恢復(fù)的freezing值明顯升高，并且兩組間無差異。這說明retrieval后的蛋白降解是AFC記憶消退自發(fā)恢復(fù)的擦除所必需的。
　　3.βLac抑制retrieval對AFC記憶消退更新的擦除
　　在做renewa

11、l實(shí)驗(yàn)時(shí)，動(dòng)物在A環(huán)境建立條件反射之后同樣分為三組:Ret組、Ret+βLac組以及NoRet組。三組的腦內(nèi)給藥方式及retrieval或者noretrieval方式同上，區(qū)別之處在于在B環(huán)境進(jìn)行。三組retrieval或者noretrieval后在B環(huán)境做消退訓(xùn)練，24小時(shí)后在B環(huán)境檢測LTM。在LTM測試24小時(shí)后，將所有動(dòng)物放置回A環(huán)境檢測動(dòng)物的記憶renewal情況時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)和Ret組相比，NoRet組和Ret+βLac組re

12、newal的freezing值明顯升高，并且兩組間無差異。
　　4.βLac抑制retrieval對AFC記憶消退復(fù)原的擦除
　　對于reinstatement實(shí)驗(yàn)，所有的實(shí)驗(yàn)都在同一環(huán)境下進(jìn)行。三組的腦內(nèi)給藥方式及retrieval或者noretrieval方式同上。所有的三組動(dòng)物在經(jīng)歷了相同水平的條件反射建立和消退訓(xùn)練之后，動(dòng)物再次暴露于相同環(huán)境下承受5次US刺激（此過程中無CS出現(xiàn)）。再過24hr之后，通過4次CS刺激

13、檢測動(dòng)物的reinstatement情況時(shí)發(fā)現(xiàn)與各自的最后四次extinctionCS相比，NoRet組和Ret+βLac組的freezing水平都有所增加，而Ret組無變化。
　　5.Retrieval后泛素化介導(dǎo)的蛋白降解增加介導(dǎo)消退記憶的擦除
　　動(dòng)物分五組:NoRetrieval后一小時(shí)取材組（NoRet組）;NoRetrieval后1小時(shí)進(jìn)行消退訓(xùn)練，訓(xùn)練后立即取材組（NoRet+Ext組）;Retrieval后一

14、小時(shí)取材組（Ret1hr組）;Retrieval后1小時(shí)進(jìn)行消退訓(xùn)練，訓(xùn)練后立即取材組（Ret+Ext組）;Retrieval后2小時(shí)取材組（Ret2hr組）。取材部位為BLA。GST-S5a多泛素化分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NoRet組與Ret2hr組的多泛素化水平都高;NoRet組與NoRet+Ext組相比多泛素化水平?jīng)]有明顯變化;Ret+Ext組多泛素化水平與NoRet+Ext組有明顯升高。
　　四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　我們首次發(fā)現(xiàn)