TNF-α介導(dǎo)炎癥-凋亡相關(guān)基因功能性多態(tài)位點(diǎn)與宮頸癌易感性及預(yù)后關(guān)系的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、宮頸癌是威脅女性健康的最常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家，是發(fā)病率最高的女性生殖道惡性腫瘤。我國每年新增病例10萬名，占全球病例的1/5，且近年來發(fā)病年齡呈逐漸年輕化的趨勢。流行病學(xué)研究已證實(shí)高危型人乳頭瘤病毒(HPV)在人體的持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因和必要條件，而只有少部分HPV感染者發(fā)展為宮頸癌患者，提示個(gè)體對于宮頸癌具有遺傳易感性。
　　腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是體內(nèi)具有多種生物活性的細(xì)胞因子，能激活凋亡激酶(cas

2、pases，CASP)家族級聯(lián)式反應(yīng)，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。但在某些細(xì)胞中，它還能激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路，招募促炎細(xì)胞因子白介素6(IL6)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和抑制凋亡。此外，TNF-α的刺激還能促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)蛋白8(TNFAIP8)的表達(dá)，抑制caspases的活化，抑制細(xì)胞凋亡。HPV E6能靶向作用于TNF-α受體，一方面抑制caspases活化，保護(hù)細(xì)胞逃避凋亡;另一方面，E6和E7協(xié)同參與調(diào)解TNF-α介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB細(xì)

3、胞增殖途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和永生化。因此，HPV也參與了對細(xì)胞增殖/凋亡的調(diào)控，而這種調(diào)控的差異在很大程度是由遺傳決定的，有可能是TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡通路中某些基因的多個(gè)功能性單核苷酸多態(tài)性(SNP)綜合作用下導(dǎo)致個(gè)體的易感性所引起的。
　　本研究首次探索性地對TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡通路相關(guān)基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、臨床治療、預(yù)后結(jié)局的關(guān)系進(jìn)行解析。我們的研究假設(shè)是:(1) TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡相關(guān)基因的潛在功能性SNP

4、s單獨(dú)或聯(lián)合作用與宮頸癌易感性相關(guān)，且可能存在基因-基因和基因-環(huán)境交互作用;(2) TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡相關(guān)基因的功能性SNPs通過特定的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制發(fā)揮作用;(3) TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡相關(guān)基因的潛在功能性SNPs與宮頸癌治療效果及臨床結(jié)局相關(guān)。
　　第一部分 TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡相關(guān)基因遺傳多態(tài)位點(diǎn)與宮頸癌易感性的關(guān)聯(lián)研究
　　為了研究TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡相關(guān)基因的潛在功能性SNPs與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的

5、相關(guān)性，我們在華東地區(qū)漢族人群中，選擇1584例宮頸癌病例和1756例年齡、居住地頻數(shù)相匹配的健康女性，開展病例-對照關(guān)聯(lián)研究，SNPs的基因分型檢測采用Taqman探針方法。在單個(gè)位點(diǎn)關(guān)聯(lián)研究中，我們發(fā)現(xiàn)攜帶TNFAIP8-rs11064 GG基因型的婦女比AA/AG基因型攜帶者罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)更高（校正OR2.16，95％ CI1.16-4.03）;相對于IL6-rs2069837 AA基因型，攜帶AG/GG基因型的婦女宮頸癌易感性

6、更高（校正OR1.27，95％ CI1.08-1.49）。盡管CASP7-rs10787498突變純合子GG基因型由于人數(shù)較少而顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是我們發(fā)現(xiàn)攜帶雜合子GT基因型的婦女比TT基因型者罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（校正OR1.19，95％ CI1.00-1.41）。此外，CASP7-rs4353229的TT基因型攜帶者較CC/CT攜帶者具有更大的宮頸癌罹患風(fēng)險(xiǎn)(OR1.20，95％ CI1.02-1.40)。
　　多個(gè)位

7、點(diǎn)的聯(lián)合分析結(jié)果顯示，相對于攜帶0-1個(gè)危險(xiǎn)基因型的婦女，當(dāng)女性攜帶2-4個(gè)陽性單位點(diǎn)的危險(xiǎn)基因型時(shí)，具有更高的宮頸癌罹患風(fēng)險(xiǎn)。我們分別對TNFAIP8、IL6、CASP7基因上的多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合效應(yīng)產(chǎn)生的相對危險(xiǎn)度均明顯高于單位點(diǎn)效應(yīng)。同時(shí)，IL6基因的兩個(gè)SNP位點(diǎn)所構(gòu)成的Grs2069837Crs2069840單倍型相較于Ars2069837Crs2069840單倍型有更高的宮頸癌發(fā)生危險(xiǎn)。此外，我們采用傳統(tǒng)L

8、ogistic回歸參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，發(fā)現(xiàn)CASP7基因SNPs之間、CASP7與IL6基因SNPs之間、環(huán)境因素與SNPs之間均存在兩因素的相乘交互作用;多因子降維(MDR)非參數(shù)模型分析進(jìn)一步顯示，TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡通路相關(guān)基因的多個(gè)SNPs位點(diǎn)間存在高階交互作用，共同參與了宮頸癌的發(fā)生過程。
　　綜上所述，盡管缺少個(gè)體HPV感染的數(shù)據(jù)，本研究證實(shí)TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡通路相關(guān)基因SNPs與中國華東地區(qū)漢族女性的宮頸癌易感性

9、相關(guān)，并初步揭示該通路相關(guān)基因-基因、基因-環(huán)境存在交互作用，在宮頸癌發(fā)生中的起了重要作用。當(dāng)然，本研究的發(fā)現(xiàn)值得在其他中國人群或其他種族人群中加以驗(yàn)證，以進(jìn)一步檢驗(yàn)我們結(jié)論的可靠性和科學(xué)性。
　　第二部分 TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡相關(guān)基因陽性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的功能學(xué)研究
　　本研究在關(guān)聯(lián)研究的基礎(chǔ)上，對有陽性關(guān)聯(lián)的SNPs進(jìn)行了功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，探尋其特定的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制。首先，我們根據(jù)HapMap基因分型與GENEVAR基因表達(dá)的數(shù)據(jù)

10、平臺，分析四個(gè)陽性關(guān)聯(lián)SNPs的不同基因型攜帶者在基因mRNA表達(dá)水平之間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNFAIP8-rs11064位點(diǎn)無論在HapMap總體人群、還是中國漢族人群中都與TNFAIP8 mRNA表達(dá)水平相關(guān)（線性回歸P=0.028和0.018）。組織芯片蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，攜帶突變G等位基因的宮頸癌患者較A等位基因攜帶者，其TNFAIP8蛋白表達(dá)顯著增加(校正OR3.57，95％ CI1.09-11.72)。在進(jìn)一步的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中，

11、我們設(shè)計(jì)了構(gòu)建攜帶TNFAIP8-rs11064不同等位基因的雙熒光報(bào)告基因表達(dá)載體，與miR-22共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于psiCHECK∶rs11064A轉(zhuǎn)染組，psiCHECK∶rs11064G轉(zhuǎn)染組的相對熒光素酶表達(dá)活性顯著增加（HeLa，SiHa，A549和SW480細(xì)胞中Student'st檢驗(yàn)P值分別為:P＜0.001，P＜0.001，P=0.009和P＜0.001），提示TNFAIP8-rs11064 A→G的改變能降

12、低miR-22結(jié)合到TNFAIP83'-UTR的親和力，導(dǎo)致TNFAIP8 mRNA表達(dá)水平的升高，激活TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡通路，使個(gè)體發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP8-rs11064位點(diǎn)上單核苷酸的變化會引起miR-22對TNFAIP8基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力的改變，從而與宮頸癌易感性顯著關(guān)聯(lián)。
　　第三部分:TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡相關(guān)基因遺傳多態(tài)位點(diǎn)對宮頸癌臨床結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)評估
　　本研究

13、在第一部分關(guān)聯(lián)研究的基礎(chǔ)上，選擇148例宮頸鱗癌患者，進(jìn)行體外MTT實(shí)驗(yàn)，以測定四種鉑類化療藥物（順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、奧沙利鉑）對宮頸癌細(xì)胞的抑制率，并隨訪患者的生存結(jié)局，分析TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡相關(guān)基因潛在功能性SNPs與四種鉑類化療藥物敏感性、患者生存的關(guān)系。結(jié)果顯示，盡管SNPs與四種鉑類化療藥物的癌細(xì)胞抑制率無顯著相關(guān)性，但TNFAIP8蛋白低表達(dá)的細(xì)胞比高表達(dá)細(xì)胞對順鉑和奈達(dá)鉑更加敏感（Wilcoxon檢驗(yàn)，P=0.043

14、和0.009），提示TNFAIP8高表達(dá)可能與宮頸癌鉑類化療藥物抵抗相關(guān)。
　　宮頸癌預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)宮頸癌患者為高FIGO分期(ⅡB期;校正HR5.53，95％ CI1.08-28.39)或腫瘤≥4 cm（校正HR3.65，95％ CI1.13-11.80）或脈管浸潤陽性（校正HR3.14，95％ CI1.10-8.94）或攜帶TNFAIP8L1-rs1060555 GG基因型（校正HR3.25，95％ CI1.06-9.95）

15、或高表達(dá)TNFAIP8蛋白(校正HR4.10，95％ CI1.38-12.15)時(shí)，其腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度顯著增加;當(dāng)脈管浸潤陽性(校正HR8.72，95％ CI1.72-44.29)或TNFAIP8蛋白高表達(dá)(校正HR4.48，95％ CI1.02-19.64)時(shí)，患者的死亡危險(xiǎn)度顯著增加。
　　本研究首次證實(shí)TNF-α介導(dǎo)炎癥/凋亡相關(guān)基因，尤其TNFAIP8家族基因的相關(guān)變異可能影響宮頸癌的發(fā)展、預(yù)后結(jié)局。我們將在本研究的基礎(chǔ)上