維A酸和涼血活血復(fù)方及黃芪注射液治療銀屑病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁
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1、背景:銀屑病是常見的慢性炎癥性、增殖性皮膚病,頑固、難治、易復(fù)發(fā),目前尚缺乏理想的治療方法。維A酸類藥物是目前治療銀屑病的主要用藥之一,臨床療效確切,但其抗病機(jī)制尚不完全明了,該藥因嚴(yán)重的毒副作用限制了臨床應(yīng)用;中藥治療銀屑病在我國歷史悠久,主要治則是涼血、活血等。我院應(yīng)用于銀屑病的涼血活血復(fù)方秉承了傳統(tǒng)中醫(yī)理論及中醫(yī)驗(yàn)方,具有涼血、活血、祛風(fēng)、理濕等功效,經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和初步的臨床研究證實(shí)對(duì)銀屑病有較好療效。黃芪注射液含有黃芪的主要有效成

2、分,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明具有免疫增強(qiáng)和免疫調(diào)節(jié)作用。以往研究證明治療銀屑病有效,但其抗病機(jī)制尚不完全明了。 目的:本研究旨在比較維A酸類藥物和傳統(tǒng)中藥方劑的臨床療效,并觀察不同的維A酸類藥物及中藥復(fù)方和黃芪注射液聯(lián)合應(yīng)用對(duì)療效的影響。在此基礎(chǔ)上考查第二代維A酸(依曲替酸)和傳統(tǒng)中藥提取物黃芪注射液對(duì)體外培養(yǎng)的永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT細(xì)胞)的增殖、凋亡及維生素D受體(VDR)表達(dá)的影響,探索銀屑病的發(fā)病機(jī)制,明確維A酸類藥

3、物治療銀屑病的可能機(jī)制。同時(shí)對(duì)比分析維A酸類藥物和傳統(tǒng)中藥的作用機(jī)理,為維A酸類藥物與中藥聯(lián)合應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:(1)臨床研究:選擇經(jīng)臨床檢查或皮膚病理活檢確診的銀屑病患者272例,按入院或接診時(shí)間分為三個(gè)治療組。芳香維A酸乙酯治療組41例口服芳香維A酸乙酯膠囊,依曲替酸治療組66例口服依曲替酸膠囊,中藥涼血活血復(fù)方治療組165例口服涼血活血復(fù)方煎劑。同時(shí)各組內(nèi)設(shè)部分患者聯(lián)合應(yīng)用黃芪注射液。采用國際通用的銀屑病皮損嚴(yán)重程

4、度評(píng)分(PASI)法判定臨床療效,對(duì)各組間的療效進(jìn)行比較,同時(shí)對(duì)各組內(nèi)應(yīng)用黃芪注射液者與未用者之間的療效進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(2)實(shí)驗(yàn)研究:免疫組化法觀察銀屑病皮損和正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)情況,鏡下計(jì)數(shù)陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù),采用半定量方法評(píng)價(jià)陽性反應(yīng)程度,比較銀屑病皮損和正常表皮VDR表達(dá)有無差異:將不同濃度的依曲替酸或黃芪注射液分別作用于體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞24h、48h、72小時(shí)。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢

5、測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響,計(jì)算生長(zhǎng)抑制率及IC50;根據(jù)MTT結(jié)果分別選定兩種藥物適宜的作用濃度及時(shí)間作用于HaCaT細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。于透射電鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài),研究依曲替酸和黃芪注射液對(duì)HaCaT細(xì)胞周期及凋亡的影響;采用Western印記法半定量檢測(cè)HaCaT細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)水平,以陰性對(duì)照組VDR蛋白表達(dá)作為基準(zhǔn),計(jì)算各用藥組VDR蛋白表達(dá)量的變化情況;Real-Time RT-PCR方法分析HaCaT細(xì)胞V

6、DR mRNA相對(duì)表達(dá)量。 結(jié)果:①芳香維A酸乙酯治療組、依曲替酸治療組、中藥涼血活血復(fù)方治療組的總有效率分別為82.9%、78.8%和64.2%:各治療組內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用黃芪治療者有效率均高于未用黃芪者;芳香維A酸乙酯組和依曲替酸組的總有效率明顯高于中藥涼血活血復(fù)方組,芳香維A酸乙酯組和依曲替酸組間療效沒有顯著性差異。②依曲替酸和黃芪均對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,作用24、48、72小時(shí),依曲替酸抑制HaCaT細(xì)胞增殖的I

7、C50分別為47.80μg/ml、27.40μg/ml、18.46μg/ml:黃芪抑制HaCaT細(xì)胞增殖的IC50分別為341.O mg/ml,252.2 mg/ml,194.3mg/ml。在一定濃度范圍內(nèi)其抑制率呈時(shí)間和劑量依賴性。③流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,各濃度組依曲替酸G1期細(xì)胞百分比均明顯增加,S期和G2期細(xì)胞百分比減少,HaCaT細(xì)胞明顯阻滯于G1期。依曲替酸30μg/ml作用48小時(shí)有明顯的凋亡峰出現(xiàn)。電鏡

8、下出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。黃芪作用48小時(shí)各期細(xì)胞比例介于依曲替酸15μg/ml和30μg/ml之間。④免疫組化:鏡下正常皮膚和銀屑病皮損標(biāo)本均見陽性染色的角質(zhì)形成細(xì)胞,即正常皮膚和銀屑病皮損都有VDR蛋白表達(dá),銀屑病皮損的表達(dá)水平明顯強(qiáng)于正常皮膚標(biāo)本(P<0.01)。陽性染色的細(xì)胞主要分布于基底細(xì)胞層,在銀屑病皮損這種分布趨勢(shì)尤其明顯。⑤Western印跡實(shí)驗(yàn):各組樣品均出現(xiàn)β-肌動(dòng)蛋白和VDR與其單克隆抗體結(jié)合產(chǎn)生的免疫印跡條

9、帶,大小分別為42 kDa和58 kDa。半定量分析結(jié)果顯示依曲替酸作用后,HaCaT細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)均較陰性對(duì)照組降低,而黃芪作用組VDR水平則與陰性對(duì)照組接近。⑥Real-Time RT-PCR方法:對(duì)樣品中的目的基因(VDRmRNA)進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析,結(jié)果顯示各用藥組HaCaT細(xì)胞VDRmRNA的相對(duì)表達(dá)量與陰性對(duì)照組相比無明顯差異,提示黃芪和各濃度依曲替酸均不能明顯改變VDR mRNA的表達(dá)。 結(jié)論:①芳香維A酸乙酯

10、膠囊、依曲替酸膠囊和中藥涼血活血復(fù)方治療銀屑病均有較好療效,其中維A酸類藥物的療效明顯優(yōu)于血活血復(fù)方,二代與三代維A酸間的療效無顯著性差異。黃芪與上述藥物聯(lián)合應(yīng)用可提高療效。②依曲替酸和黃芪均對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,且在一定濃度范圍內(nèi)其抑制率呈明顯的時(shí)間和劑量依賴性。二者亦可干擾HaCaT細(xì)胞周期,細(xì)胞阻滯于G1期,使之不能進(jìn)入G2/M期進(jìn)行分裂增殖;依曲替酸和黃芪作用于HaCaT細(xì)胞后均可誘導(dǎo)其凋亡,提示依曲替酸和黃芪的

11、抗銀屬病機(jī)制可能與此有關(guān)。③正常皮膚和銀屬病皮損表皮都有VDR蛋白表達(dá),銀屑病皮損的VDR蛋白表達(dá)水平明顯高于正常皮膚標(biāo)本;銀屑病皮損陽性染色的細(xì)胞明顯集中分布于基底細(xì)胞層。提示表皮細(xì)胞VDR蛋白異常表達(dá)可能是銀屑病的發(fā)病機(jī)制之一,同時(shí)也可能是1,25(OH)2D3衍生物治療銀屑病有效的分子基礎(chǔ)。④依曲替酸可使HaCaT細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)減少,但不改變VDRmRNA水平,分析可能是依曲替酸促進(jìn)了HaCaT細(xì)胞VDR蛋白降解,或者依曲替酸

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