凋亡調(diào)控基因與血管衰老相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、21世紀(jì)全球進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的老齡化社會(huì)，全球老齡化社會(huì)的到來使發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家同樣面臨嚴(yán)重的人口社會(huì)問題。據(jù)中國老齡化工作委員會(huì)辦公室2006年12月23日公布《中國人口老齡化發(fā)展趨勢預(yù)測研究報(bào)告》：2005年底中國60歲以上人口近1.44億，占總?cè)丝诒壤?1％，2037年超過4億，我國老年人口正以年均3％的速度增長。為應(yīng)對老齡化社會(huì)帶來的巨大人口健康問題，滿足我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)實(shí)現(xiàn)長期可持續(xù)發(fā)展的重大需求，國家實(shí)施戰(zhàn)略計(jì)劃，自2000年起

2、設(shè)立重大衰老攻關(guān)課題(973課題)。而血管衰老研究成為緊要的社會(huì)需求，血管結(jié)構(gòu)、功能隨增齡發(fā)生的特征性重塑稱之為血管衰老。臨床研究證實(shí)，隨增齡，許多心血管疾病發(fā)生率急劇上升，如高血壓病、冠心病、心功能不全、腦卒中等。有研究指出老年人心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的增加是增齡與疾病相互作用(age-disease interactions)的結(jié)果；Baltimore衰老縱向研究證實(shí)年齡相關(guān)的動(dòng)脈特征性變化與增齡依賴的血管疾病的急劇增高密切相關(guān)。在我們前期

3、“973”課題研究中血管衰老的機(jī)制研究取得如下成果：衰老血管有其特征性結(jié)構(gòu)和功能改變；隨增齡Ang Ⅱ增高并從mRNA水平上調(diào)NADPH氧化酶p22phox表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧生成增加可能是血管衰老的主要原因之一；活性氧在介導(dǎo)血管及內(nèi)皮細(xì)胞衰老中有重要作用。血管衰老機(jī)理的研究是防治衰老血管重塑及相關(guān)疾病的基石。血管衰老是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，增齡引起的血管改變可能成為治療和預(yù)防血管疾病的靶目標(biāo)。 細(xì)胞凋亡學(xué)說是較為公認(rèn)的衰

4、老機(jī)理學(xué)說。其理論認(rèn)為，衰老是細(xì)胞自發(fā)的、主動(dòng)的過程，即生物從發(fā)育到衰老，在體預(yù)先即有時(shí)間安排，該時(shí)間安排稱為“生物鐘”，由基因程序所決定。由于啟動(dòng)衰老的基因存在與“關(guān)閉了開關(guān)”基因(多效應(yīng)定時(shí)基因)的存在，啟動(dòng)和關(guān)閉衰老現(xiàn)象的發(fā)生，均按照時(shí)間程序進(jìn)行，稱“程序性細(xì)胞死亡”(programmed cell death，PCD)或“細(xì)胞凋亡”(apoptosis)?？刂粕L發(fā)育的基因在各個(gè)時(shí)期均可開啟或關(guān)閉，有些在生命晚期發(fā)揮作用的基因可

5、能控制衰老?；虬l(fā)生突變或基因功能喪失，是衰老主要原因，程序衰老理論能更好解釋衰老現(xiàn)象。 有研究指出血管結(jié)構(gòu)、功能隨增齡發(fā)生改變即血管衰老直接改變了各種心血管疾病發(fā)生的閾值和嚴(yán)重度，而血管衰老與損傷是造成人類死亡的主要原因之一。因此，為應(yīng)對老齡化社會(huì)帶來的巨大人口健康問題，血管衰老的研究將成為緊要的社會(huì)需求。近年來，細(xì)胞凋亡與衰老關(guān)系的研究也受到重視，細(xì)胞凋亡與衰老過程中組織器官功能的退化及衰老相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如帕

6、金森氏病、老年癡呆和動(dòng)脈粥樣硬化等都被認(rèn)為與器官的老化有關(guān)。目前值得注意的是細(xì)胞凋亡引起血管衰老的機(jī)制尚不清楚，故我們設(shè)計(jì)如下的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證凋亡調(diào)控基因與血管衰老相關(guān)性，并探討血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(Angiotensin Ⅱ Receptor Blocker,ARB)纈沙坦(Valsartan)的干預(yù)作用，旨在從基因及蛋白水平，揭示血管衰老可能發(fā)生的機(jī)制。 方法： 1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn) (1)細(xì)胞分組：體

7、外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)分為對照組、AngⅡ組、Valsartan組，AngⅡ及Valsartan的終濃度均為10-6mol/L(2) 細(xì)胞衰老程度鑒定：通過β-gal染色、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析鑒定細(xì)胞衰老程度(3) 通過AnnexinV-FICT標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡早期事件的發(fā)生(4) 熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化(5) RT-PCR分析各組細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3的

8、mRNA表達(dá)(6) Western blot分析各組細(xì)胞Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)分組：Wistar健康大鼠60只分成3組：青年組(3-4月齡，n=20只)；18-20月齡大鼠隨機(jī)分為兩組：衰老組(n=20只)、Valsartan組(n=20只)，衰老組正常飲水，Valsartan組(n=20只，飲用水予以Valsartan 30mg．Kg-1.D-1)，相同條件下喂養(yǎng)至22-24月齡(2) 石蠟

9、切片制備及HE染色，Masson染色(3) 血漿MOD、SOD檢測(4) 主動(dòng)脈順應(yīng)性測定(5) 主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2、Bax免疫組化染色檢測(6) 分別應(yīng)用RT-PCR和Western bolt檢測各組大鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)結(jié)果1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)經(jīng)AngⅡ刺激后，HUVECs的β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞向G0-G1期停滯，熒光顯微鏡可見明顯的細(xì)胞凋亡，透射電子顯微鏡可見細(xì)胞衰老的特征性改變

10、和細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮和凝聚。與Ang Ⅱ誘導(dǎo)組相比，Valsartan組Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增高，Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)水平降低。 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 隨增齡，大鼠的主動(dòng)脈管壁增厚，順應(yīng)性下降，內(nèi)皮功能受損，與衰老組相比，Valsartan組血漿丙二醛濃度明顯降低，超氧化物歧化酶濃度明顯升高；主動(dòng)脈血管的順應(yīng)性增高，其中彈性面積有顯著性差異；Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增高，B

11、ax的mRNA和Caspase-3及蛋白表達(dá)水平降低。 結(jié)論： 1.AngⅡ可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞老化，從而復(fù)制細(xì)胞衰老。 2.AngⅡ誘導(dǎo)的衰老HUVECs發(fā)生凋亡，提示細(xì)胞凋亡參與了AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs衰老的過程；細(xì)胞凋亡是AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs老化的特征之一。 3.Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的分子機(jī)制之一可能與Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達(dá)的失衡和Caspase-3的mRNA及