犬肺癌模型抑癌基因表達(dá)與血管造影相關(guān)性實驗研究.pdf

1、目的:探討經(jīng)氣管插管由同軸微導(dǎo)管超選擇定位，精確定位灌注甲基膽葸(MCA)、二乙基亞硝胺(DEN)超液化碘油混懸液，誘導(dǎo)犬肺癌模型，為肺癌深入研究提供新平臺；通過X線胸片、血管造影檢查與基因檢測、免疫組化及病理觀察，探討肺癌早期病理變化與影像學(xué)表現(xiàn)的關(guān)系，為早期肺癌的影像學(xué)診斷提供理論依據(jù)；從分子生物學(xué)角度探討抑癌基因p53、p16表達(dá)與早期肺癌之間的關(guān)系，為肺癌早期診斷提供參考指標(biāo)。 材料與方法:實驗犬年齡1-3歲，體重21-

2、25Kg的雜種犬22只，雌雄兼有，隨機將22只犬分為5組，全身麻醉，經(jīng)氣管插管由同軸微導(dǎo)管精確定位向右肺膈葉灌注致癌藥物(甲基膽葸(M C A)0.25g+二乙基亞硝胺(D E N)0.38g+超液化碘油混懸液3 ml)分組：A組(4只)、B組(4只)、C組(4只)、D組(5只)、E組(5只)各組均行X線胸片動態(tài)觀察，分別觀察至1、3、6、12、18個月，處死A組、B組、C組、D組、E組實驗犬，取注藥部位肺組織，加10％中性福爾馬林固定

3、，石蠟包埋(切片厚度5μm)H·E染色，根據(jù)標(biāo)本染色情況，選取結(jié)構(gòu)完整標(biāo)本進行后續(xù)染色觀察及統(tǒng)計處理。對E組(觀察18個月)5只實驗犬行支氣管動脈造影(BAG)犬全身麻醉后，經(jīng)右側(cè)股動脈穿刺，采用改良式Seldinger技術(shù)，行選擇性支氣管動脈造影。穿刺成功后，經(jīng)導(dǎo)絲置入導(dǎo)管鞘和C<,3>導(dǎo)管，在胸主動脈近氣管隆突附近以后、右、前、左的順序?qū)ふ抑夤軇用}開口。當(dāng)導(dǎo)管頭有嵌頓、落空感，不再隨心臟搏動而移動時，經(jīng)導(dǎo)管注入少量造影劑，確定導(dǎo)管

4、進入支氣管動脈后，行DSA支氣管動脈造影。應(yīng)用高壓注射器以每秒2ml的速度注入4ml造影劑，觀察支氣管動脈造影的表現(xiàn)。觀察有無支氣管動脈和肋間動脈共干，是否左右支氣管動脈共干，支氣管動脈是否增粗、變形，有無腫瘤血管及染色，是否存在其它動脈向腫瘤供血。通過DSA表現(xiàn)，分析在動脈期、實質(zhì)期(毛細(xì)血管期)和靜脈期的BAG結(jié)果，確定腫瘤的供血動脈來源、形態(tài)及腫瘤染色情況。造影結(jié)束后，肌注抗菌素預(yù)防感染。病理學(xué)檢查，所有標(biāo)本行HE染色，通過光鏡、

5、電鏡觀察灌注致癌物部位在誘發(fā)癌變過程中肺組織病理變化；采用免疫組化染色方法檢測p53、p16基因表達(dá)有無異常；選取CD31血管內(nèi)皮標(biāo)記測定致癌部位內(nèi)血管生成情況。采用病理圖像分析系統(tǒng)對標(biāo)本HE染色切片進行形態(tài)計量與分別計數(shù)方法，免疫組化染色片統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果: 1．x線胸片觀察：3個月時局部沉積的致癌質(zhì)超液化碘油的密度較前變淡。隨觀察時間的延長，致癌質(zhì)超液化碘油的密度逐漸變淡，范圍較前縮小，可明顯指示注藥部位。6個

6、月時部分犬(2只犬)在注藥部位出現(xiàn)可疑軟組織團塊狀影。18個月時胸片上未見明顯確切的類圓形軟組織團塊狀影。 2．血管造影觀察：對誘導(dǎo)18個月的5條犬進行支氣管動脈造影，顯示多數(shù)支氣管動脈與肋間動脈共干，由支氣管動脈向灌注致癌物區(qū)供血。支氣管動脈增粗，迂曲、走行紊亂的腫瘤樣血管及染色。右側(cè)支氣管動脈多為兩支，分別供應(yīng)不同肺葉，1只犬可見左右支氣管動脈共干。 3．病理觀察： 5只犬中4只誘導(dǎo)為肺癌及癌前相關(guān)損害。病理類型包括

7、鱗癌和細(xì)支氣管肺泡癌(簡稱肺泡癌)。鱗癌標(biāo)本光鏡下見膠原基質(zhì)表面鱗狀上皮癌變，向膠原深層呈索狀侵入；于膠原表面呈腔狀，內(nèi)含脫落的鱗癌細(xì)胞；侵入膠原基質(zhì)的鱗癌細(xì)胞，基本組織類型為多角形及梭形癌細(xì)胞。電鏡下見癌細(xì)胞有大核仁，胞漿內(nèi)可見張力原纖維。細(xì)支氣管肺泡癌標(biāo)本光鏡下見肺泡癌細(xì)胞部分呈細(xì)支氣管粘液腺上皮分化，腺泡癌細(xì)胞呈復(fù)層，極性喪失，腺管結(jié)構(gòu)紊亂，腺腔中有共壁的癌細(xì)胞；臨近組織均顯有肺不張。電鏡下見核大，核仁多而大，大量不整形核仁協(xié)同染

8、色質(zhì)，胞漿極少，呈多數(shù)不規(guī)則突起，細(xì)胞間連接分化不成熟。18個月時，該方法誘導(dǎo)肺癌及癌前相關(guān)損害成功率為80％(4/5)。 4．免疫組化檢測：檢測p53、p16基因蛋白在灌注致癌物部位肺組織中表達(dá)呈陽性，腫瘤細(xì)胞呈棕黃色染色。P53與p16分別在1、3、6、12、18個月觀察灌注致癌物部位肺癌組織基因表達(dá)，檢測結(jié)果p53基因蛋白隨癌變誘導(dǎo)時間增加，陽性表達(dá)率逐漸升高；p16基因蛋白陽性表達(dá)逐漸減低。CD31血管內(nèi)皮標(biāo)記表達(dá)陽性。

9、發(fā)現(xiàn)異常增生血管。 結(jié)論: 1．采用經(jīng)氣管插管由同軸微導(dǎo)管精確定位灌注甲基膽蒽、二乙基亞硝胺和超液化碘油混懸液方法，成功誘導(dǎo)出經(jīng)病理學(xué)及分子生物學(xué)證實的近似人類原發(fā)性支氣管肺癌的犬肺癌模型。 2．CD31血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記呈陽性，腫瘤血管異常增生，證實支氣管動脈造影征象為腫瘤血管及染色。 3．抑癌基因P53、p16隨誘導(dǎo)癌變時間增加，陽性表達(dá)異常與肺癌早期發(fā)病密切相關(guān)，p53基因突變與p16基因失活是肺癌發(fā)