IMB聯(lián)合SEM、LSM檢測乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：惡性腫瘤的一個重要標(biāo)志是轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者最終治療失敗的主要原因。乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤，雖然采取了以手術(shù)為主的綜合治療措施，但遠(yuǎn)期生存率并沒有獲得明顯提高，影響預(yù)后的主要因素是發(fā)生了遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。臨床發(fā)現(xiàn)，約25～30％腋淋巴結(jié)陰性患者于術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗。因此，對于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的早期檢測及治療成為提高乳腺癌患者遠(yuǎn)期生存率的途徑之一。骨髓是乳腺癌最易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的部位，骨髓微轉(zhuǎn)移(bone mar

2、row microrrletastasis，BMM)是指在骨髓抽吸或活檢標(biāo)本中檢出了腫瘤細(xì)胞，而患者無任何臨床、影像學(xué)上遠(yuǎn)處或骨髓轉(zhuǎn)移的證據(jù)，它常以單個細(xì)胞或微小細(xì)胞團(tuán)形式存在。如果能在早期檢測到微小轉(zhuǎn)移灶，則對疾病的分期、治療、判斷并改善預(yù)后具有重要意義。 乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移檢測方法很多，如免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等，這些方法取得了令人欣慰的結(jié)果，體現(xiàn)了潛在的應(yīng)用價值，但都存在一定的局限性，如腫瘤細(xì)胞表面

3、抗原表達(dá)不均一、假性基因的存在、約2～10％的抗膜抗體對健康人骨髓細(xì)胞有抗原反應(yīng)等，都可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，并且這些方法多不能從形態(tài)學(xué)上證實(shí)腫瘤細(xì)胞的存在。本研究利用包備有抗上皮細(xì)胞粘附因子的納米級免疫磁珠(anti-epithelial cell adtaesion molectlle-immunomagnetic bead，anti-EpCnom bead AM-IMB)富集乳腺癌患者骨lmmunomagnetic bead,ant

4、i-EpAAM-IMB)富集乳腺癌患者骨髓中轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，將富集后細(xì)胞通過掃描電鏡(scanningelectron microscope，SEM)從形態(tài)學(xué)上證實(shí)腫瘤細(xì)胞的存在，同時用結(jié)合異硫氰酸熒光素的抗細(xì)胞角蛋白抗體(anti-cytokeratin-fluorescein isothiocyanate，anti-CK-FITC)標(biāo)記富集后細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡(laser scanningmicroscope，LSM)下檢測C

5、K<'+>細(xì)胞，聯(lián)用兩種標(biāo)記物(anti-EpCAM、anti-CK)的敏感性及SEM、LSM的特異性，避免了由于交叉反應(yīng)所造成的假陽性，同時從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了腫瘤細(xì)胞的存在，進(jìn)一步探討乳腺癌BMM與影響乳腺癌預(yù)后的臨床因素、病理因素的關(guān)系，明確乳腺癌BMM與預(yù)后的關(guān)系，為臨床制定合理的治療方案、評價預(yù)后提供理論依據(jù)。 方法：本研究隨機(jī)取自2006年3月至10月在我院所收治經(jīng)病理證實(shí)乳腺癌患者45例，健康志愿者4例(49例均已在

6、骨髓穿刺知情同意書上簽字)。研究對象均為女性，年齡30～67歲，平均49.8歲。術(shù)前在局部浸潤麻醉下，髂前上棘行骨髓穿刺，抽取骨髓10～15ml，淋巴細(xì)胞分離液離心分層，收集有核細(xì)胞，IMB富集陽性對照、陰性對照、乳腺癌患者骨髓中轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，將富集后細(xì)胞分成兩等份，一份在SEM下采集腫瘤細(xì)胞圖像，另一份用anti-CK-FITC標(biāo)記細(xì)胞，在LSM下檢測CK<'+>細(xì)胞。將MDA-231乳腺癌細(xì)胞株制作成電鏡標(biāo)本，SEM下采集標(biāo)準(zhǔn)腫瘤

7、細(xì)胞圖象。統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS13.0軟件，行×列表X<'2>檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。判斷標(biāo)準(zhǔn)：P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1．特異性檢測：4份陽性對照在SEM、LSM下同時檢測到腫瘤細(xì)胞，4份陰性對照在SEM、LSM下均未檢測到腫瘤細(xì)胞。 2.45例乳腺癌骨髓標(biāo)本中，16例在SEM、LSM下同時檢測到腫瘤細(xì)胞，BMM陽性檢出率為35.6％。 3.45例乳腺癌BMM與原發(fā)腫瘤大小的關(guān)系：

8、乳腺癌BMM陽性率隨著原發(fā)腫瘤增大而增高，腫瘤直徑≤2cm組、2～5cm組及>5cm組BMM陽性率分別為11.1％、30.8％、70.0％，有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.020)。 4．45例乳腺癌BMM與臨床病理TNM分期的關(guān)系：乳腺癌BMM陽性率隨著臨床病理分期增加而增高，臨床I期組BMM陽性率為20.0％、Ⅱ期組25.0％、Ⅲ期組87.5％，差異有顯著意義(P=0.003)。 5．45例乳腺癌BMM與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況的關(guān)

9、系：雖然腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組BMM陽性率48.0％高于無轉(zhuǎn)移組(20.0％)，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.053)。進(jìn)一步分層研究發(fā)現(xiàn)，隨著腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目增加BMM陽性率增高，腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目≥4個組BMM陽性率為58.8％高于腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目1～3個組(25.0％)及無腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(20.0％)，P=0.038。 6.45例乳腺癌BMM與年齡、月經(jīng)狀況的關(guān)系：本研究未發(fā)現(xiàn)乳腺癌BMM與年齡、月經(jīng)狀況有關(guān)(P>0.05)。 7

10、．45例乳腺癌BMM與組織學(xué)分級、病理類型的關(guān)系：45例乳腺癌BMM陽性率隨著組織學(xué)分級增加而升高，組織學(xué)分化I級組BMM陽性率為9.1％低于Ⅱ級組(33.3％)及Ⅲ級組(61．5％)，有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.027)。本研究未發(fā)現(xiàn)乳腺癌BMM與病理類型有關(guān)(P>0.05)。 8.45例乳腺癌BMM與ER、PR、C-erbB．2、VEGF在腫瘤組織表達(dá)的關(guān)系：乳腺癌BMM陽性率隨著ER、PR蛋白表達(dá)增強(qiáng)而降低，ER、PR陽性組BM

11、M陽性率分別為18.2％、7.7％低于ER、PR陰性組(52.2％、46.9％)，差異有顯著意義(P<0.05)。本研究未發(fā)現(xiàn)乳腺癌BMM與C-erbB-2、VEGF在腫瘤組織的表達(dá)有關(guān)(P>0.05)。 結(jié)論：1．IMB聯(lián)合SEM、LSM檢測原發(fā)性乳腺癌：BMM陽性檢出率為35.6％。4份陽性對照在SEM、LSM下同時檢測到腫瘤細(xì)胞，4份陰性對照在SEM、LSM下均未檢測到腫瘤細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞特異性為100％。2．乳腺

12、癌BMM與原發(fā)腫瘤大小及臨床病理TNM分期有關(guān)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力隨著原發(fā)腫瘤增大而增強(qiáng)，臨床分期越晚，出現(xiàn)骨髓轉(zhuǎn)移幾率越高。但腫塊小、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的I期乳腺癌患者，亦存在約20％的BMM，提示乳腺癌是一種全身性疾病，轉(zhuǎn)移及播散很早即可發(fā)生，故臨床上應(yīng)常規(guī)進(jìn)行BMM檢測，可以更早、更準(zhǔn)確地了解患者全身播散情況。3．雖然乳腺癌BMM與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無關(guān)，但進(jìn)一步分層研究發(fā)現(xiàn)，隨著腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目增加BMM陽性率增高，說明血行播散與淋巴結(jié)

13、轉(zhuǎn)移是乳腺癌轉(zhuǎn)移的兩條相對獨(dú)立的途徑，當(dāng)腋窩淋巴結(jié)出現(xiàn)較多轉(zhuǎn)移時，癌細(xì)胞可能通過淋巴導(dǎo)管再次入血從而增加了轉(zhuǎn)移機(jī)會。因此，對臨床分期早、腫塊小、腋淋巴結(jié)陰性患者，應(yīng)常規(guī)行BMM檢測，發(fā)現(xiàn)具有早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移危險的高危人群，制定相應(yīng)的“個體化”治療原則。4．乳腺癌BMM陽性率隨著組織學(xué)分級增加而升高，說明分化程度低的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，對這部分病人應(yīng)加強(qiáng)化療等綜合性治療，密切關(guān)注全身轉(zhuǎn)移情況。5．乳腺癌BMM陽性率隨著E

14、R、PR蛋白表達(dá)增強(qiáng)而降低，ER、PR蛋白表達(dá)為陽性時，BMM的幾率降低，說明分化愈差的腫瘤細(xì)胞，ER、PR丟失愈多，可能具有更強(qiáng)的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，提示ER、PR陰性乳腺癌患者比ER、PR陽性患者血行轉(zhuǎn)移的風(fēng)險性可能更大。6．本研究未發(fā)現(xiàn)乳腺癌BMM與年齡、月經(jīng)狀況、病理類型及腫瘤組織中C-erbB-2、VEGF的表達(dá)有關(guān)。7．乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的檢測與部分傳統(tǒng)臨床指標(biāo)及一些生物學(xué)因子在乳腺癌預(yù)后判斷上存在一致性，且更能反映腫瘤細(xì)胞