DEDD抑制乳腺癌生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移.pdf

1、腫瘤轉(zhuǎn)移是最主要的實(shí)體腫瘤致死原因。轉(zhuǎn)移是一個(gè)多環(huán)節(jié)的過程：腫瘤細(xì)胞對(duì)其周圍組織侵襲；穿過血管/淋巴管壁進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)；通過循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)端并在此穿出管壁在遠(yuǎn)端組織形成轉(zhuǎn)移灶；轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)最終形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。目前對(duì)于轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚。死亡受體結(jié)構(gòu)域(Deatheffectordomains，DEDs)是蛋白發(fā)生相互作用的區(qū)域，含有DED的蛋白可以介導(dǎo)由死亡受體觸發(fā)的程序性細(xì)胞死亡或凋亡。DED本身沒有酶活性而是作為其他DEDs的結(jié)合區(qū)域

2、，因而促進(jìn)蛋白復(fù)合體形成。FADD、caspase8以及DEDD均屬于含有DED結(jié)構(gòu)域的蛋白。研究表明，DEDD通過活化caspase3或capase6在CD95介導(dǎo)的凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。近來發(fā)現(xiàn)DEDD也參與細(xì)胞周期調(diào)控并抑制有絲分裂進(jìn)程。我們最近研究發(fā)現(xiàn)DEDD與核因子smad3相互作用，抑制后者的生物學(xué)功能。然而，DEDD在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中的具體作用尚不清楚。
　　 目的：
　　 以乳腺癌為研究對(duì)象，研究

3、DEDD在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中所發(fā)揮的生物學(xué)作用，并闡明DEDD在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 免疫組化檢測(cè)人乳腺癌和結(jié)腸癌病理標(biāo)本中DEDD的表達(dá)水平；Westernblot檢測(cè)不同惡性程度人乳腺癌細(xì)胞株中DEDD的表達(dá)水平；構(gòu)建pcDNA3.1-DEDD表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建pSliencer-DEDDshRNA干擾質(zhì)粒；在低轉(zhuǎn)移的MCF7細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染pSliencer-DEDDshRNA，潮

4、霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)DEDD-shRNA的干擾細(xì)胞株，在高轉(zhuǎn)移的MDA-MA-231細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DEDD，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)DEDD的過表達(dá)細(xì)胞株；transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力；Westernblot和confocal檢測(cè)EMT相關(guān)指標(biāo)E-cadherin，β-catenin，Vimentin，a-SMA變化情況。Westernblot檢測(cè)EMT調(diào)節(jié)因子Snail，Twist等的變化，蛋白降解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Sna

5、il，Twist降解等。
　　 結(jié)果：
　　 本研究發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌和結(jié)腸癌病理標(biāo)本中，DEDD表達(dá)水平與腫瘤的不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。檢測(cè)不同惡性程度的人乳腺癌細(xì)胞株，及其他組織腫瘤細(xì)胞株中DEDD的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，DEDD與腫瘤細(xì)胞株的惡性程度呈負(fù)相關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾MCF7細(xì)胞株中DEDD的表達(dá)之后，其生長(zhǎng)、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力大大增加；相應(yīng)的在MDA-MB-231中過表達(dá)DEDD之后，可以顯著抑制其生長(zhǎng)、遷

6、移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。干擾DEDD之后，可誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞發(fā)生上皮間葉轉(zhuǎn)化(EMT)，下調(diào)上皮樣標(biāo)志E-cadherin和β-catenin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間葉樣標(biāo)志Vimentin和α-SMA的表達(dá)；相應(yīng)的在穩(wěn)定表達(dá)DEDD的MDA-MB-231中，其上皮間葉轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程發(fā)生逆轉(zhuǎn)，E-cadherin和β-catenin的表達(dá)上調(diào)，而Vimentin和a-SMA則顯著下調(diào)。干擾DEDD可誘導(dǎo)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail，Twist

7、和Slug的表達(dá)，而過表達(dá)DEDD使得上述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)降低。通過報(bào)告基因檢測(cè)和蛋白降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DEDD對(duì)Snail，Twist的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在降解水平。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Snail與LC3存在共定位，說明其可通過自噬途徑進(jìn)行降解，抑制自噬可抑制Snail的降解。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DEDD可以與自噬調(diào)節(jié)因子PI3KⅢ/Beclin1復(fù)合物相互作用，并維持后者的穩(wěn)定性，進(jìn)而維持自噬的活性。最后在干擾DEDD的MCF7細(xì)胞中過表達(dá)PI3KⅢ/