飲用水中碘乙酸毒作用機(jī)制研究.pdf

1、工農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展導(dǎo)致廢水排放量激增，水體污染日趨嚴(yán)重，原水水質(zhì)不斷惡化?，F(xiàn)行的常規(guī)水處理工藝已難以完全清除水中眾多的污染物，且在飲用水消毒過程中，消毒劑還將與水中存在的有機(jī)和無機(jī)前體物反應(yīng)生成具有有害效應(yīng)的消毒副產(chǎn)物。早期毒理學(xué)研究表明，飲用水有機(jī)提取物具有致突變性、遺傳毒性、生殖毒性和發(fā)育毒性，可以引起氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等。近年的流行病學(xué)研究也表明，飲用氯消毒的飲用水可導(dǎo)致膀胱癌、直腸癌和多種不良生殖結(jié)局，包括低體重兒、

2、小于胎齡兒和早產(chǎn)等。由于飲用水中的污染物既可來自原水也可來自加工過程，種類多樣，組份極為復(fù)雜，受分析技術(shù)和研究工作復(fù)雜性的制約，以往的研究并不了解究竟是何種污染物引起的效應(yīng)。近年來，隨著污染物譜解析技術(shù)的長足進(jìn)步和暴露組理念的發(fā)展，基于GC-MS和LC-MS/MS導(dǎo)向的污染物譜分析，增進(jìn)了對飲用水中污染物暴露特征和污染物種類數(shù)量的認(rèn)識。而毒理學(xué)研究也由傳統(tǒng)的基于整體動物的高劑量染毒、從動物外推至人，發(fā)展到基于毒性通路機(jī)制和人源性細(xì)胞系的

3、污染物毒效應(yīng)研究，并且這種理念在學(xué)術(shù)界和管理機(jī)構(gòu)產(chǎn)生了重大反響。為此，美國科學(xué)委員會于2007年出版發(fā)布了《21世紀(jì)的毒性測試》，高度概括了化學(xué)物質(zhì)毒性測試研究的核心思想和發(fā)展遠(yuǎn)景。鑒于此，本研究在對飲用水污染物特征分析的基礎(chǔ)上，選擇了可對健康產(chǎn)生潛在影響的重要污染物碘乙酸(IAA)，開展了基于毒性機(jī)制的毒理學(xué)研究。
　　飲用水污染物組份錯綜復(fù)雜，含量范圍從數(shù)十納克至毫克每升不等，因此，對飲水中污染物混合效應(yīng)的評價界定極為困難。然

4、而，飲用水中污染物的毒性效應(yīng)仍然有一定規(guī)律可循。例如:先前研究已表明，氧化應(yīng)激在飲用水整體混合污染物和某些污染物引起的細(xì)胞毒性和遺傳毒性中具有重要作用，提示水污染引起的氧化應(yīng)激通路值得關(guān)注。由于氧化應(yīng)激是機(jī)體在內(nèi)外環(huán)境刺激下的基本防御機(jī)制，氧化應(yīng)激可直接或間接氧化及損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，進(jìn)而誘發(fā)基因突變、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化，因而氧化應(yīng)激在毒性機(jī)制中具有重要作用?，F(xiàn)有研究表明氧化應(yīng)激和適應(yīng)性反應(yīng)可能是某些污染物毒性效應(yīng)的共同機(jī)制，

5、因此，以特異的氧化應(yīng)激信號通路為基礎(chǔ)的毒效應(yīng)分析研究有望增進(jìn)了解飲用水中低劑量混合暴露對人群健康的潛在影響。Nrf-2(nuclear factor E2-related factor2)/ARE(antioxidant response element)信號通路在機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中極為關(guān)鍵。Nrf-2作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和抑制氧化損傷及炎癥。Nrf2缺失或激活障礙，將引起細(xì)

6、胞對應(yīng)激原的敏感性增高，與化學(xué)促癌的發(fā)生和細(xì)胞凋亡等病變過程相關(guān)。研究表明氧化應(yīng)激在具有動物致癌性的MX和與人群腫瘤相關(guān)的微囊藻毒素聯(lián)合暴露的毒效應(yīng)機(jī)制中具有重要作用。由于飲用水中的污染物是機(jī)體可能的應(yīng)激源，因此，利用氧化應(yīng)激效應(yīng)通路模型研究飲用水混合污染物毒理學(xué)效應(yīng)將為污染物的混合暴露評價方法提供新的思路。
　　圍繞上述思路，本研究在飲用水污染物特征分析的基礎(chǔ)上，首先研究了飲用水中混合污染物對Nrf2/ARE效應(yīng)通路的影響，發(fā)現(xiàn)

7、單獨(dú)作用并未引起ARE活性改變的污染物，在低劑量混合暴露時可引起Nrf2/ARE效應(yīng)通路顯著改變。結(jié)合飲用水污染物特征分析，選擇了飲用水中含量雖低，但前期初步研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有極強(qiáng)毒效應(yīng)的新型消毒副產(chǎn)物碘乙酸，圍繞氧化應(yīng)激效應(yīng)通路在遺傳毒性中的作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，證實了Nrf2通路的激活在IAA引起的細(xì)胞毒性和遺傳毒性機(jī)制中具有重要作用。繼而，采用基因芯片技術(shù)研究了IAA對HcpG2細(xì)胞基因表達(dá)和調(diào)控的影響，以期找到IAA毒性相關(guān)分

8、子機(jī)制。研究結(jié)果將為認(rèn)識IAA的毒效應(yīng)機(jī)制和開展基于機(jī)制的健康風(fēng)險評估奠定重要基礎(chǔ)，同時，也為未來研究制定國家生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分飲用水污染物低劑量混合暴露對Nrf2/ARE信號通路的影響
　　低劑量混合暴露是飲用水污染物暴露的現(xiàn)實特征。傳統(tǒng)毒理學(xué)評價模式從單一污染物、高劑量的動物實驗結(jié)果外推至人群，存在諸多不確定性，同時也不能確定含量低、但毒效應(yīng)強(qiáng)的組分引起的健康效應(yīng)及其累加

9、效應(yīng)。由于氧化應(yīng)激是機(jī)體重要防御機(jī)制，其中Nrf2在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、抑制氧化損傷，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶反應(yīng)中發(fā)揮核心作用。因此，本研究首先通過基于GC-MS、GC-ECD和LC-MS/MS的污染譜特征分析技術(shù)揭示飲用水污染物整體暴露特征，繼而以Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)研究飲用水中提取的有機(jī)污染物引起的Nrf2蛋白聚積、Nrf2相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)和ARE熒光素酶報告基因活性等效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn):飲用水污染譜中的單一污染物在10

10、00至100萬倍環(huán)境濃度才使Nrf2/ARE響應(yīng)，但8倍于環(huán)境濃度的整體污染物即可改變Nrf2/ARE活性。而且，以污染譜組分配置的模擬混合污染物也在8倍環(huán)境濃度時可以改變Nrf2/ARE活性，證實了Nrf2效應(yīng)通路是分析評價混合污染物效應(yīng)的敏感方法，經(jīng)模擬水樣和實際水樣的雙重驗證，揭示了低劑量混合污染物引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)特征。這一基于毒性機(jī)制的混合污染物評價方法有望在環(huán)境污染物混合暴露的風(fēng)險評估中得到廣泛應(yīng)用。
　　與此同時，根

11、據(jù)飲用水中污染物的污染特征分析，明確了飲用水中主要污染物。通過查詢分析毒理學(xué)資料，選擇了上海市飲用水中檢出率高、毒作用強(qiáng)的污染物碘乙酸進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。
　　第二部分碘乙酸對十種人源性細(xì)胞系的細(xì)胞毒性、遺傳毒性比較研究
　　碘乙酸是原水中存在的碘化物在飲用水消毒過程中被液氯或氯胺消毒劑氧化后生成的新型消毒副產(chǎn)物。盡管IAA在飲用水中的濃度處于數(shù)百納克至微克水平，相對于主要的消毒副產(chǎn)物THMs和HAAs含量較低，但由于IAA

12、對鼠傷寒沙門氏菌具有強(qiáng)致突變性，對哺乳動物細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性，經(jīng)IAA惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可引起裸鼠腫瘤，且人群在日常生活中經(jīng)飲水終生暴露，因此，碘乙酸對人群健康的潛在影響備受重視。2012年美國消毒副產(chǎn)物高登論壇(Gordon Research Conference on Disinfection by-products)將IAA和NDMA類消毒副產(chǎn)物列為亟需關(guān)注的消毒副產(chǎn)物。目前，鑒于人群流行病學(xué)資料和毒理學(xué)資料的充分性不足

13、，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)尚未對IAA的致癌性類別進(jìn)行劃分，世界衛(wèi)生組織(WHO)的飲用水水質(zhì)指南和包括中國在內(nèi)的所有國家暫未對飲用水中的IAA提出限量要求。但是，美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)已經(jīng)開始關(guān)注飲用水中IAA的潛在危害。
　　重要的是，上海地處長江入?？?，受咸潮影響，海水中的鹵化物會隨著咸潮逆流而上，使得原水水源中的鹵化物明顯增加，當(dāng)采用氯化消毒時即會形成消毒副產(chǎn)物IAA。因此，IAA的毒效應(yīng)及其機(jī)制研究對于健康風(fēng)險評估

14、和飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的研制具有重要價值。
　　有關(guān)碘乙酸具有極強(qiáng)細(xì)胞毒性和遺傳毒性的證據(jù)主要來自中國倉鼠卵巢細(xì)胞和人TK6、HepG2細(xì)胞，但人源性細(xì)胞的遺傳毒性結(jié)果并不一致。而且，由于IAA進(jìn)入機(jī)體后將隨血液分配至其他器官和組織，因而研究IAA對不同類型人源性細(xì)胞系的細(xì)胞毒性和遺傳毒性，對于了解IAA的敏感性靶器官具有重要意義。因此，本研究以10種人源細(xì)胞系為對象，研究比較了不同細(xì)胞系暴露于IAA引起的細(xì)胞毒性、遺傳毒性差異。研究結(jié)

15、果顯示，不同細(xì)胞對IAA的敏感性差異較大，IAA對人原代細(xì)胞系HEK-a的細(xì)胞毒性是Eca-109細(xì)胞的14倍，細(xì)胞毒性大小依次為:HEK-a＞SW579＞5637＞MGC80-3＞HepG2＞HaCAT＞CaCo-2≈PBL＞293＞Eca-109細(xì)胞;胞質(zhì)阻滯微核實驗結(jié)果顯示，IAA對于不同細(xì)胞的相對遺傳毒性潛能大小依次為:PBL＞SW579＞HepG2＞MGC80-3＞293＞CaCo2＞HaCAT＞HEK-a細(xì)胞，對Eca-10

16、9和5637細(xì)胞無遺傳毒性。此外，通過對微核進(jìn)行著絲粒蛋白A（CENP-A）免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)含著絲粒的微核在所有微核中占據(jù)較高比例，提示IAA可能通過干擾姐妹染色單體或染色體分離，誘導(dǎo)非整倍性染色體而致遺傳毒性。
　　第三部分 Nrf2/ARE氧化應(yīng)激信號通路在碘乙酸毒效應(yīng)機(jī)制中的作用研究
　　氧化應(yīng)激與適應(yīng)性反應(yīng)是毒物毒作用和機(jī)體防御的基本機(jī)制。以往研究發(fā)現(xiàn)IAA可以導(dǎo)致活性氧自由基(ROS)增加，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)在IA

17、A的毒性作用中具有重要作用，然而，準(zhǔn)確的機(jī)制尚不清楚。由于外源性化學(xué)物主要通過肝臟代謝，選擇肝細(xì)胞系作為研究對象可較好地反映受試物的基本毒性特征，且HepG2細(xì)胞具有DNA修復(fù)系統(tǒng)和Ⅱ相解毒酶系，因此，本研究以人源性的HepG2細(xì)胞系為對象，研究Nrf2/ARE氧化應(yīng)激信號通路在IAA毒效應(yīng)機(jī)制中的作用。本研究通過檢測Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)發(fā)現(xiàn)，IAA可顯著增強(qiáng)NRF2蛋白、ARE熒光素酶報告基因活性、NRF

18、2基因及其下游抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶基因GCLC, NQO1，HO-1的表達(dá)和GSH水平，且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。為研究Nrf2在IAA毒效應(yīng)中的特定作用，應(yīng)用敲除NRF2基因的HepG2細(xì)胞觀察IAA引起的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NRF2基因缺失可使細(xì)胞對IAA細(xì)胞毒性的敏感性增加，且IAA在敲除NRF2基因的HepG2細(xì)胞中的微核形成率顯著增加。為判定IAA誘導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)是否能被天然抗氧化劑姜黃素阻斷，在暴露IAA前，先以10μ

19、M姜黃素預(yù)處理HepG2細(xì)胞1小時，結(jié)果表明姜黃素預(yù)處理可以有效降低IAA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性，提示激活Nrf2信號通路可降低IAA的毒性。為驗證結(jié)果的可靠性，以IAA染毒SD大鼠24小時，發(fā)現(xiàn)100倍環(huán)境濃度的IAA急性暴露使雄性大鼠肝臟的Nrf2和Gclc基因的表達(dá)顯著增加，而1000倍環(huán)境濃度的IAA染毒可使Nrf2，Keap1，Ho-1，Nqo1和Gclc基因的表達(dá)均顯著高于對照組。上述結(jié)果表明Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)在IA

20、A引起的毒效應(yīng)中具有重要作用，提示Nrf2可以作為IAA毒效應(yīng)的生物標(biāo)志物。
　　第四部分基于基因芯片數(shù)據(jù)分析的碘乙酸毒作用分子機(jī)制研究
　　從基因組或系統(tǒng)水平上闡明生命現(xiàn)象是人類后基因組時代的基本要務(wù)。盡管IAA已被證實具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性、遺傳毒性和致瘤性，其毒性機(jī)制研究較為有限，僅有的高通量試驗是基于DNA損傷信號通路和氧化應(yīng)激/抗氧化防御信號通路的PCR Array，尚無從整體層面剖析IAA毒作用分子機(jī)制的毒理基因組學(xué)

21、研究。由于任何毒作用的發(fā)生都是細(xì)胞調(diào)節(jié)通路及其網(wǎng)絡(luò)整體紊亂的結(jié)果，從單個信號通路或某一功能性“模塊”來剖析細(xì)胞對環(huán)境刺激的應(yīng)答，頗具局限性。本研究以期應(yīng)用毒理基因組學(xué)的方法研究IAA對HepG2細(xì)胞基因表達(dá)和調(diào)控的影響，通過“cDNA芯片—miRNA芯片”數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，高通量篩選出負(fù)相關(guān)差異表達(dá)基因和miRNA，大幅度縮小目的基因和miRNA的選擇范圍;進(jìn)而通過基因間相互作用關(guān)系的構(gòu)建，將基因間的調(diào)控關(guān)系以信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的形式整理出來，從