飲用水中碘乙酸毒作用機制研究.pdf

1、工農業(yè)的迅猛發(fā)展導致廢水排放量激增，水體污染日趨嚴重，原水水質不斷惡化。現行的常規(guī)水處理工藝已難以完全清除水中眾多的污染物，且在飲用水消毒過程中，消毒劑還將與水中存在的有機和無機前體物反應生成具有有害效應的消毒副產物。早期毒理學研究表明，飲用水有機提取物具有致突變性、遺傳毒性、生殖毒性和發(fā)育毒性，可以引起氧化應激、細胞凋亡和細胞惡性轉化等。近年的流行病學研究也表明，飲用氯消毒的飲用水可導致膀胱癌、直腸癌和多種不良生殖結局，包括低體重兒、

2、小于胎齡兒和早產等。由于飲用水中的污染物既可來自原水也可來自加工過程，種類多樣，組份極為復雜，受分析技術和研究工作復雜性的制約，以往的研究并不了解究竟是何種污染物引起的效應。近年來，隨著污染物譜解析技術的長足進步和暴露組理念的發(fā)展，基于GC-MS和LC-MS/MS導向的污染物譜分析，增進了對飲用水中污染物暴露特征和污染物種類數量的認識。而毒理學研究也由傳統(tǒng)的基于整體動物的高劑量染毒、從動物外推至人，發(fā)展到基于毒性通路機制和人源性細胞系的

3、污染物毒效應研究，并且這種理念在學術界和管理機構產生了重大反響。為此，美國科學委員會于2007年出版發(fā)布了《21世紀的毒性測試》，高度概括了化學物質毒性測試研究的核心思想和發(fā)展遠景。鑒于此，本研究在對飲用水污染物特征分析的基礎上，選擇了可對健康產生潛在影響的重要污染物碘乙酸(IAA)，開展了基于毒性機制的毒理學研究。
　　飲用水污染物組份錯綜復雜，含量范圍從數十納克至毫克每升不等，因此，對飲水中污染物混合效應的評價界定極為困難。然

4、而，飲用水中污染物的毒性效應仍然有一定規(guī)律可循。例如:先前研究已表明，氧化應激在飲用水整體混合污染物和某些污染物引起的細胞毒性和遺傳毒性中具有重要作用，提示水污染引起的氧化應激通路值得關注。由于氧化應激是機體在內外環(huán)境刺激下的基本防御機制，氧化應激可直接或間接氧化及損傷DNA、蛋白質和脂質，進而誘發(fā)基因突變、蛋白質變性和脂質過氧化，因而氧化應激在毒性機制中具有重要作用?，F有研究表明氧化應激和適應性反應可能是某些污染物毒性效應的共同機制，

5、因此，以特異的氧化應激信號通路為基礎的毒效應分析研究有望增進了解飲用水中低劑量混合暴露對人群健康的潛在影響。Nrf-2(nuclear factor E2-related factor2)/ARE(antioxidant response element)信號通路在機體氧化應激反應中極為關鍵。Nrf-2作為重要的核轉錄因子參與調控細胞內抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達，維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和抑制氧化損傷及炎癥。Nrf2缺失或激活障礙，將引起細

6、胞對應激原的敏感性增高，與化學促癌的發(fā)生和細胞凋亡等病變過程相關。研究表明氧化應激在具有動物致癌性的MX和與人群腫瘤相關的微囊藻毒素聯合暴露的毒效應機制中具有重要作用。由于飲用水中的污染物是機體可能的應激源，因此，利用氧化應激效應通路模型研究飲用水混合污染物毒理學效應將為污染物的混合暴露評價方法提供新的思路。
　　圍繞上述思路，本研究在飲用水污染物特征分析的基礎上，首先研究了飲用水中混合污染物對Nrf2/ARE效應通路的影響，發(fā)現

7、單獨作用并未引起ARE活性改變的污染物，在低劑量混合暴露時可引起Nrf2/ARE效應通路顯著改變。結合飲用水污染物特征分析，選擇了飲用水中含量雖低，但前期初步研究已經發(fā)現具有極強毒效應的新型消毒副產物碘乙酸，圍繞氧化應激效應通路在遺傳毒性中的作用進行了較為系統(tǒng)的研究，證實了Nrf2通路的激活在IAA引起的細胞毒性和遺傳毒性機制中具有重要作用。繼而，采用基因芯片技術研究了IAA對HcpG2細胞基因表達和調控的影響，以期找到IAA毒性相關分

8、子機制。研究結果將為認識IAA的毒效應機制和開展基于機制的健康風險評估奠定重要基礎，同時，也為未來研究制定國家生活飲用水水質衛(wèi)生標準提供了重要的基礎數據和科學依據。
　　第一部分飲用水污染物低劑量混合暴露對Nrf2/ARE信號通路的影響
　　低劑量混合暴露是飲用水污染物暴露的現實特征。傳統(tǒng)毒理學評價模式從單一污染物、高劑量的動物實驗結果外推至人群，存在諸多不確定性，同時也不能確定含量低、但毒效應強的組分引起的健康效應及其累加

9、效應。由于氧化應激是機體重要防御機制，其中Nrf2在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、抑制氧化損傷，調控細胞內抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶反應中發(fā)揮核心作用。因此，本研究首先通過基于GC-MS、GC-ECD和LC-MS/MS的污染譜特征分析技術揭示飲用水污染物整體暴露特征，繼而以Nrf2介導的抗氧化反應研究飲用水中提取的有機污染物引起的Nrf2蛋白聚積、Nrf2相關調控基因的表達和ARE熒光素酶報告基因活性等效應。研究發(fā)現:飲用水污染譜中的單一污染物在10

10、00至100萬倍環(huán)境濃度才使Nrf2/ARE響應，但8倍于環(huán)境濃度的整體污染物即可改變Nrf2/ARE活性。而且，以污染譜組分配置的模擬混合污染物也在8倍環(huán)境濃度時可以改變Nrf2/ARE活性，證實了Nrf2效應通路是分析評價混合污染物效應的敏感方法，經模擬水樣和實際水樣的雙重驗證，揭示了低劑量混合污染物引起的氧化應激反應特征。這一基于毒性機制的混合污染物評價方法有望在環(huán)境污染物混合暴露的風險評估中得到廣泛應用。
　　與此同時，根

11、據飲用水中污染物的污染特征分析，明確了飲用水中主要污染物。通過查詢分析毒理學資料，選擇了上海市飲用水中檢出率高、毒作用強的污染物碘乙酸進行進一步深入研究。
　　第二部分碘乙酸對十種人源性細胞系的細胞毒性、遺傳毒性比較研究
　　碘乙酸是原水中存在的碘化物在飲用水消毒過程中被液氯或氯胺消毒劑氧化后生成的新型消毒副產物。盡管IAA在飲用水中的濃度處于數百納克至微克水平，相對于主要的消毒副產物THMs和HAAs含量較低，但由于IAA

12、對鼠傷寒沙門氏菌具有強致突變性，對哺乳動物細胞具有較強的細胞毒性和遺傳毒性，經IAA惡性轉化的細胞可引起裸鼠腫瘤，且人群在日常生活中經飲水終生暴露，因此，碘乙酸對人群健康的潛在影響備受重視。2012年美國消毒副產物高登論壇(Gordon Research Conference on Disinfection by-products)將IAA和NDMA類消毒副產物列為亟需關注的消毒副產物。目前，鑒于人群流行病學資料和毒理學資料的充分性不足

13、，國際癌癥研究機構(IARC)尚未對IAA的致癌性類別進行劃分，世界衛(wèi)生組織(WHO)的飲用水水質指南和包括中國在內的所有國家暫未對飲用水中的IAA提出限量要求。但是，美國環(huán)境保護局(EPA)已經開始關注飲用水中IAA的潛在危害。
　　重要的是，上海地處長江入海口，受咸潮影響，海水中的鹵化物會隨著咸潮逆流而上，使得原水水源中的鹵化物明顯增加，當采用氯化消毒時即會形成消毒副產物IAA。因此，IAA的毒效應及其機制研究對于健康風險評估

14、和飲用水衛(wèi)生標準的研制具有重要價值。
　　有關碘乙酸具有極強細胞毒性和遺傳毒性的證據主要來自中國倉鼠卵巢細胞和人TK6、HepG2細胞，但人源性細胞的遺傳毒性結果并不一致。而且，由于IAA進入機體后將隨血液分配至其他器官和組織，因而研究IAA對不同類型人源性細胞系的細胞毒性和遺傳毒性，對于了解IAA的敏感性靶器官具有重要意義。因此，本研究以10種人源細胞系為對象，研究比較了不同細胞系暴露于IAA引起的細胞毒性、遺傳毒性差異。研究結

15、果顯示，不同細胞對IAA的敏感性差異較大，IAA對人原代細胞系HEK-a的細胞毒性是Eca-109細胞的14倍，細胞毒性大小依次為:HEK-a＞SW579＞5637＞MGC80-3＞HepG2＞HaCAT＞CaCo-2≈PBL＞293＞Eca-109細胞;胞質阻滯微核實驗結果顯示，IAA對于不同細胞的相對遺傳毒性潛能大小依次為:PBL＞SW579＞HepG2＞MGC80-3＞293＞CaCo2＞HaCAT＞HEK-a細胞，對Eca-10

16、9和5637細胞無遺傳毒性。此外，通過對微核進行著絲粒蛋白A（CENP-A）免疫熒光染色，發(fā)現含著絲粒的微核在所有微核中占據較高比例，提示IAA可能通過干擾姐妹染色單體或染色體分離，誘導非整倍性染色體而致遺傳毒性。
　　第三部分 Nrf2/ARE氧化應激信號通路在碘乙酸毒效應機制中的作用研究
　　氧化應激與適應性反應是毒物毒作用和機體防御的基本機制。以往研究發(fā)現IAA可以導致活性氧自由基(ROS)增加，提示氧化應激反應在IA

17、A的毒性作用中具有重要作用，然而，準確的機制尚不清楚。由于外源性化學物主要通過肝臟代謝，選擇肝細胞系作為研究對象可較好地反映受試物的基本毒性特征，且HepG2細胞具有DNA修復系統(tǒng)和Ⅱ相解毒酶系，因此，本研究以人源性的HepG2細胞系為對象，研究Nrf2/ARE氧化應激信號通路在IAA毒效應機制中的作用。本研究通過檢測Nrf2介導的抗氧化反應和細胞內谷胱甘肽(GSH)發(fā)現，IAA可顯著增強NRF2蛋白、ARE熒光素酶報告基因活性、NRF

18、2基因及其下游抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶基因GCLC, NQO1，HO-1的表達和GSH水平，且具有劑量-效應關系。為研究Nrf2在IAA毒效應中的特定作用，應用敲除NRF2基因的HepG2細胞觀察IAA引起的細胞毒性和遺傳毒性。結果發(fā)現，NRF2基因缺失可使細胞對IAA細胞毒性的敏感性增加，且IAA在敲除NRF2基因的HepG2細胞中的微核形成率顯著增加。為判定IAA誘導的抗氧化反應是否能被天然抗氧化劑姜黃素阻斷，在暴露IAA前，先以10μ

19、M姜黃素預處理HepG2細胞1小時，結果表明姜黃素預處理可以有效降低IAA誘導的細胞毒性和遺傳毒性，提示激活Nrf2信號通路可降低IAA的毒性。為驗證結果的可靠性，以IAA染毒SD大鼠24小時，發(fā)現100倍環(huán)境濃度的IAA急性暴露使雄性大鼠肝臟的Nrf2和Gclc基因的表達顯著增加，而1000倍環(huán)境濃度的IAA染毒可使Nrf2，Keap1，Ho-1，Nqo1和Gclc基因的表達均顯著高于對照組。上述結果表明Nrf2介導的抗氧化反應在IA

20、A引起的毒效應中具有重要作用，提示Nrf2可以作為IAA毒效應的生物標志物。
　　第四部分基于基因芯片數據分析的碘乙酸毒作用分子機制研究
　　從基因組或系統(tǒng)水平上闡明生命現象是人類后基因組時代的基本要務。盡管IAA已被證實具有極強的細胞毒性、遺傳毒性和致瘤性，其毒性機制研究較為有限，僅有的高通量試驗是基于DNA損傷信號通路和氧化應激/抗氧化防御信號通路的PCR Array，尚無從整體層面剖析IAA毒作用分子機制的毒理基因組學

21、研究。由于任何毒作用的發(fā)生都是細胞調節(jié)通路及其網絡整體紊亂的結果，從單個信號通路或某一功能性“模塊”來剖析細胞對環(huán)境刺激的應答，頗具局限性。本研究以期應用毒理基因組學的方法研究IAA對HepG2細胞基因表達和調控的影響，通過“cDNA芯片—miRNA芯片”數據聯合分析，高通量篩選出負相關差異表達基因和miRNA，大幅度縮小目的基因和miRNA的選擇范圍;進而通過基因間相互作用關系的構建，將基因間的調控關系以信號轉導網絡的形式整理出來，從