鏈延伸及肽核酸石英諧振式基因傳感器陣列檢測系統(tǒng)的實驗研究.pdf

1、目的:構建石英諧振式基因傳感器陣列檢測系統(tǒng),以鏈延伸技術及肽核酸探針兩種方法提高傳感器陣列檢測靈敏度,并探索對臨床標本進行直接檢測的可行性.方法:1.首先利用精細微加工法制作單個石英諧振式傳感器,并在其兩面光刻出金膜電極,比較了不同電極厚度及直徑對基因雜交檢測的影響.在此基礎上先后構建了粘膠式2×5型傳感器陣列以及夾具式2×5型傳感器陣列.并自行開發(fā)研制自激式振蕩電路、PESAV2.0版頻率記錄分析軟件.將它們與計算機聯(lián)用以構建石英諧振

2、式基因傳感器陣列檢測系統(tǒng).2.分別用巰基固定法及生物素-親和素固定法將人類乳頭瘤病毒的探針固定在基因傳感器陣列的金膜表面,并具體比較了兩種方法的優(yōu)劣.3.基因傳感器陣列表面分別固定上金黃色葡萄球菌mecA及femA兩種探針片段,待雜交上相應的靶序列片段后,加入Klenow酶在室溫下進行鏈延伸反應.4.在傳感器陣列表面固定上HBV的bis-PNA探針,并具體摸索了bis-PNA探針與HBV基因組DNA雜交時的最佳pH值、最佳離子濃度、最佳

3、探針固定量、以及靶序列結合量對頻率下降值的影響,并對靶序列量和對應頻率下降值的關系進行了線性回歸處理.結論: 1.夾具式2×5型傳感器陣列在液相中振蕩時穩(wěn)定性更高. 2.自激式振蕩電路對石英諧振式基因傳感器陣列的液相振蕩進行了特別的優(yōu)化,使傳感器陣列能夠在液相中更穩(wěn)定地工作. 3."PESAV2.0"應用軟件是一類可實時記錄與分析石英晶體諧振頻率的新型實用性軟件. 4.將上述組件組合在一起所構建出的第三代檢測系統(tǒng)為后續(xù)實驗搭建了一個堅實

4、的技術平臺,相信也可以為臨床上病原性微生物的檢測以及多種疾病的早期診斷提供一種與常規(guī)的檢測方法完全不同的新方法.5. 兩種探針固定方法均能有效地將探針固定在石英諧振式傳感器陣列金膜表面.兩種方法各有優(yōu)缺點,具體采用何種方法固定基因探針,還得根據(jù)具體的情況進行詳盡的分析. 6.鏈延伸反應成功地將傳感器的檢測靈敏度從0.5nM提高到0.05nM.使臨床上痕量DNA的檢測成為可能.但反應耗時較長、影響因素較多、且無法對基因組DNA進行直接檢測

5、. 7.弱酸性的雜交環(huán)境(pH6.8)對bis-PNA和HBVdsDNA雜交反應的順利進行至關重要.實驗結果從另一個角度證實了bis-PNA和由DNA雜交過程中"Hoogsteen鏈第一"的觀點. 8.離子濃度也極大地影響了雜交反應的時間,低鹽離子濃度更有利于提高bis-PNA和dsDNA的雜交速率,高鹽離子濃度則會大大降低biS-PNA的結合速率. 9.1.5μM bis-PNA探針固定濃度最為適宜.而雜交反應引起的頻率下降值隨靶序列