雙體肽核酸漏聲表面波基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、目的： 1．在前期研究基礎(chǔ)上改進(jìn)漏聲表面波(LSAW)基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)； 2．設(shè)計(jì)雙體肽核酸(bisPNA)探針，結(jié)合具有高靈敏度和高精確度的新型LSAW傳感器，構(gòu)建一種全新的bisPNA-LSAW基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)； 3．摸索液相中bisPNA和靶序列雜交的影響因素，并優(yōu)化出最佳反應(yīng)條件。 方法 1．利用精細(xì)微加工方法制備雙端諧振型LSAW傳感器：在前期研究的雙延遲線(xiàn)型LSAW傳感器的基礎(chǔ)上進(jìn)

2、行改進(jìn)，在其兩端加入反射柵陣列，構(gòu)建出了新型的雙端對(duì)諧振型LSAW傳感器。 2．改進(jìn)現(xiàn)有的振蕩電路以及數(shù)據(jù)采集分析軟件，并加入新型的溫控系統(tǒng)，構(gòu)建出新型的LsAW基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)。 3．在新型的LsAW傳感器表面固定上HPV的DNA探針，根據(jù)前期研究摸索出的液相最佳反應(yīng)條件，加入已知的互補(bǔ)靶序列，觀察探針與靶序列雜交引起的相位變化，與改進(jìn)前的傳感器作比較。 4．探討并優(yōu)化bisPNA-LSAW基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)

3、進(jìn)行液相檢測(cè)時(shí)的各種影響因素(包括：最佳pH值、最佳離子濃度、最佳探針固定量等)，并確定傳感器檢測(cè)的靈敏度和線(xiàn)性范圍。 結(jié)果 1．反射柵陣列使輸入輸出叉指換能器之間反復(fù)傳播的信號(hào)行程增加，DNA探針與相應(yīng)的靶序列雜交時(shí)引起的相位變化幅度較改進(jìn)前有了很大的提高。 2．?dāng)?shù)據(jù)采集分析軟件的改進(jìn)提高了檢測(cè)的效率和檢測(cè)的精度。將數(shù)據(jù)采集分析軟件的核心程序進(jìn)行優(yōu)化和升級(jí)，使運(yùn)行更穩(wěn)定，處理速度更快。溫度控制系統(tǒng)的引入提供了生

4、物學(xué)反應(yīng)的最佳溫度環(huán)境。 3．在不同pH值緩沖液中，bis-PNA與靶序列反應(yīng)引起的相位變化有明顯差異，隨著雜交時(shí)緩沖液pH值從5.8升到8.0，雜交導(dǎo)致的相位下降值先高后低，pH6.6與pH6.8時(shí)傳感器響應(yīng)信號(hào)最大，但兩者反應(yīng)所達(dá)到的平衡時(shí)間有明顯差異(P<0.01)，pH值6.6時(shí)檢測(cè)所需時(shí)間更短。當(dāng)pH值從6.6升到8.0時(shí)，雜交平衡所用的時(shí)間驟然增加。 4．當(dāng)鈉離子濃度從10mmol/L增加至100mmol/L

5、時(shí)，傳感器的相位變化先升后降，以20mmol/L為分水嶺；而雜交平衡時(shí)間則隨著離子濃度的增加也逐漸增加，且各組間差異顯著。 5．探針濃度從0.001μmol/L到4.0μmol/L變化時(shí)，與HPV靶序列雜交所引起的相位變化值是先升后降，探針濃度過(guò)大時(shí)反而抑制雜交，以1.0μmol/L探針濃度為分界線(xiàn)。雜交平衡時(shí)間上各組間未見(jiàn)明顯的變化趨勢(shì)。 6．隨著HPV靶序列濃度從1pg/L到1mg/L變化時(shí)，雜交所引起的相位變化值先

6、升后趨于緩和，以100μg/L靶序列濃度為飽和點(diǎn)；在1pg/L到100μg/L的HPV靶序列濃度范圍內(nèi)，相位變化與靶序列濃度的線(xiàn)性回歸方程為△P=2.3392 1gC+14.584，相關(guān)系數(shù)r<'2>=0.9622。而雜交平衡時(shí)間上卻未見(jiàn)明顯的變化趨勢(shì)。 結(jié)論 1．雙端諧振型LSAW傳感器比前期研制的雙延遲線(xiàn)型LSAW傳感器更適合液相中分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。反射柵陣列的引入有效地增加了傳感器檢測(cè)的信噪比，增加了傳感器的靈

7、敏度。 2．改進(jìn)后的LSAW傳感器檢測(cè)系統(tǒng)在振蕩電路、溫控系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集分析軟件等方面達(dá)到試驗(yàn)要求。 3．弱酸性(pH6.6)的雜交環(huán)境對(duì)bisPNA和HPV dsDNA雜交反應(yīng)的順利進(jìn)行至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果從另一個(gè)角度證實(shí)了bisPNA和dsDNA雜交過(guò)程中“Hoogsteen鏈第一”的觀點(diǎn)。 4．離子濃度也是個(gè)重要的影響因素，低鹽離子濃度不但有利于增加bis-PNA和dsDNA的結(jié)合信號(hào)，更有利于提高bis-P