阿爾茨海默病人外周血單核細(xì)胞組織蛋白酶及其抑制因子表達(dá)異常的病理意義.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease， AD)是一種年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，最終發(fā)展為進(jìn)行性癡呆，AD的主要神經(jīng)病理特征是細(xì)胞外存在大量由β淀粉樣蛋白(beta-amyloid protien，Aβ)高度聚集形成的老年斑(senile plaques，SP)、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)、神經(jīng)元缺失以及皮質(zhì)動(dòng)脈和小動(dòng)脈的血管淀粉樣變性。其發(fā)病

2、原因復(fù)雜，至今尚未完全闡明。目前認(rèn)同的觀點(diǎn)是:Aβ的水平是由其產(chǎn)生和清除之間的平衡決定的;Aβ在腦內(nèi)的沉積是AD發(fā)病的早期過(guò)程和中心環(huán)節(jié)。發(fā)病早期活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以清除Aβ，隨著病情進(jìn)展，這種由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)將成為慢性的神經(jīng)毒性，產(chǎn)生大量的有害因子，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。
　　總體來(lái)說(shuō)，Aβ的水平是由其產(chǎn)生和清除之間的平衡決定的，若Aβ的清除障礙導(dǎo)致腦內(nèi)形成沉積斑塊。
　　巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是體內(nèi)固有的免疫細(xì)胞，可以

3、清除病原體及有害代謝產(chǎn)物，有研究顯示AD病人的血源性單核/巨噬細(xì)胞能夠穿過(guò)血腦屏障遷移入腦，但不能有效清除炎性斑塊內(nèi)的Aβ。而AD患者腦內(nèi)固有的小膠質(zhì)細(xì)胞雖然呈現(xiàn)炎癥、吞噬及致炎反應(yīng)的特征，但并不具備吞噬能力。以APP轉(zhuǎn)基因小鼠為模AD型進(jìn)行的研究表明，絕大多數(shù)浸潤(rùn)到腦內(nèi)Aβ斑塊周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源于骨髓;而非腦內(nèi)固有小膠質(zhì)細(xì)胞。由此看來(lái)，AD患者及APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)固有的小膠質(zhì)細(xì)胞雖然對(duì)Aβ沉積呈現(xiàn)出了炎性反應(yīng)，而血源性巨噬細(xì)胞卻不

4、能有效清除Aβ。所以得出結(jié)論:AD患者先天性免疫功能缺陷可能是腦內(nèi)Aβ沉積引發(fā)炎性反應(yīng)的主要原因。
　　發(fā)病早期，小膠質(zhì)細(xì)胞在AD病人腦內(nèi)聚集能夠促進(jìn)Aβ的清除、延緩病情進(jìn)展，然而盡管隨著病情進(jìn)展，入腦的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量不斷增加，但最終還是形成Aβ斑塊，提示這些遷移入腦的骨髓源性小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于Aβ的清除能力有所下降。
　　那么對(duì)于AD患者，其外周血單核細(xì)胞為什么不能同樣有效地清除Aβ從而達(dá)到限制病程進(jìn)展的目的？我們通過(guò)采集30

5、個(gè)AD患者及26個(gè)同年齡健康對(duì)照者的外周血并分離單核細(xì)胞，進(jìn)行mRNA的基因芯片分析，旨在對(duì)AD病人和正常老年人外周血單核細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異進(jìn)行研究，同時(shí)篩選有意義的基因，研究其在AD病人外周血單核細(xì)胞表達(dá)異常的病理意義。
　　方法：
　　1、篩選AD病人及同年齡健康對(duì)照者外周血單核細(xì)胞中表達(dá)差異的基因
　　(1) AD病人外周血單核細(xì)胞的分離:選取沈陽(yáng)地區(qū)AD病30例，同年齡健康對(duì)照26例，用肝素抗凝處理過(guò)的試管，

6、于清晨空腹采肘靜脈血，室溫放置，采血后3h內(nèi)用分離人外周血單核細(xì)胞的Dynabeads(R)CD14磁珠試劑盒分離人外周血單核細(xì)胞，用Trazol裂解后提取總RNA并委托公司進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。
　　(2)根據(jù)芯片檢測(cè)結(jié)果，篩選有表達(dá)差異的基因，并選取其中的Cathepsin D和Cystatin F基因進(jìn)行研究。
　　2、AD病人外周血單核細(xì)胞Cathepsin D表達(dá)異常對(duì)Aβ降解的影響
　　(1)采用定量PCR方法

7、驗(yàn)證AD病人外周血單核細(xì)胞中Cathepsin D基因表達(dá)的變化。
　　(2)分別采集5個(gè)AD病人及5個(gè)健康對(duì)照者外周血，免疫磁珠法分離人外周血單核細(xì)胞，用Cathepsin D activity assay kit測(cè)定Cathepsin D活性變化。
　　(3)以Cathepsin D的抑制劑Pepstatin A處理THP-1和U937后，觀察其活性變化。
　　(4)采用ELISA方法檢測(cè)Pepstatin A處理

8、后THP-1對(duì)于Aβ的降解的影響。
　　(5)利用慢病毒載體，構(gòu)建特異性Cathepsin D基因沉默的RNA干擾質(zhì)粒，制備得到高滴度的慢病毒顆粒。
　　(6)用慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞THP-1，建立Cathepsin D基因低表達(dá)的單克隆細(xì)胞系。
　　(7)采用ELISA方法檢測(cè)低表達(dá)Cathepsin D的單核細(xì)胞對(duì)于Aβ降解的影響。
　　(8)采用免疫組化方法分析低表達(dá)Cathepsin D單核細(xì)胞對(duì)于AP

9、P/PS1小鼠腦片內(nèi)Aβ清除的影響。
　　3、探討Cathepsin D基因表達(dá)異常是否為代償性改變
　　(1)利用本課題組建立的腦內(nèi)沉積Aβ的大鼠動(dòng)物模型（即在大鼠海馬部位注入Aβ1-42后成功觀察到大鼠腦內(nèi)Aβ沉積），我們?cè)诖笫蠛ｑR部位注入Aβ1-42術(shù)后3d和7d分別采集外周血并分離單核細(xì)胞。
　　(2)采用定量PCR方法檢測(cè)大鼠外周血單核細(xì)胞中Cathepsin D表達(dá)的變化。
　　4、AD病人外周血單核

10、細(xì)胞Cystatin F基因表達(dá)異常對(duì)Aβ降解的影響
　　(1)采用定量PCR方法驗(yàn)證AD病人外周血單核細(xì)胞中Cystatin F表達(dá)的變化。
　　(2)利用慢病毒載體，構(gòu)建特異性Cystatin F基因沉默的RNA干擾質(zhì)粒，制備得到高滴度的慢病毒顆粒。
　　(3)利用慢病毒載體，構(gòu)建特異性Cystatin F基因高表達(dá)的RNA干擾質(zhì)粒，制備得到高滴度的慢病毒顆粒。
　　(4)用慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞的模式細(xì)胞U

11、937/THP-1，建立Cystatin F基因沉默或高表達(dá)的單克隆細(xì)胞系。
　　(5)采用ELISA方法檢測(cè)特異性Cystatin F基因沉默對(duì)于Aβ降解的影響。
　　(6)采用免疫組化方法檢測(cè)特異性Cystatin F基因過(guò)表達(dá)對(duì)于APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ清除的影響。
　　結(jié)果：
　　1、篩選出AD病人和同年齡對(duì)照者外周血單核細(xì)胞中表達(dá)差異的基因
　　(1)與同齡對(duì)照者相比，AD病人Cathepsin

12、 D基因表達(dá)下調(diào)、活性下降。
　　(2)與同齡對(duì)照者相比，AD病人Cystatin F基因表達(dá)上調(diào)。
　　2、 Cathepsin D表達(dá)下調(diào)不利于單核細(xì)胞對(duì)Aβ的降解
　　(1)經(jīng)Cathepsin D抑制劑Pepstatin A處理后，THP-1/U937中Cathepsin D活性下降。
　　(2)Pepstatin A能抑制THP-1/U937對(duì)于Aβ的降解。
　　(3)慢病毒介導(dǎo)特異性Cathep

13、sin D基因沉默THP-1單克隆細(xì)胞株對(duì)于Aβ的降解能力下降。
　　(4)慢病毒介導(dǎo)特異性Cathepsin D基因沉默THP-1單克隆細(xì)胞對(duì)于AD小鼠腦片內(nèi)Aβ斑塊的清除能力下降。
　　(5)腦內(nèi)沉積Aβ的大鼠動(dòng)物模型外周血單核細(xì)胞中Cathepsin D表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　3、 Cystatin F表達(dá)異常能夠影響U937/THP-1對(duì)于Aβ的降解
　　(1)慢病毒介導(dǎo)特異性Cystatin F基因沉默U

14、937單克隆細(xì)胞株對(duì)于外源性Aβ的降解能力下降。
　　(2)慢病毒介導(dǎo)Cystatin F高表達(dá)THP-1單克隆細(xì)胞株能促進(jìn)對(duì)外源性Aβ的降解。
　　(3)慢病毒介導(dǎo)特異性Cystatin F基因過(guò)表達(dá)THP-1單克隆細(xì)胞有助于AD小鼠腦片內(nèi)Aβ斑塊的清除
　　結(jié)論：
　　1、 AD患者外周血單核細(xì)胞中Cathepsin D表達(dá)下調(diào)、活性下降，而Cystatin F表達(dá)上調(diào);
　　2、 Cathepsin