基因芯片檢測大鼠心肌頓抑相關(guān)基因的差異表達(dá)及左心室注射地爾硫卓對頓抑心肌功能的影響.pdf

1、心肌頓抑是一種常見的臨床現(xiàn)象，1975年Heyndrickx等首次描述了這種心肌缺血后收縮功能障礙延遲恢復(fù)的現(xiàn)象，1982年Braunwald等明確提出心肌頓抑的概念。開始僅僅認(rèn)為心肌頓抑是一種實驗室現(xiàn)象未引起重視，但在二十世紀(jì)九十年代之后，缺血性心臟病人通過各種方式可以獲得冠狀動脈的再通，因此對這種現(xiàn)象的研究成為熱點(diǎn)。
　　 多年來人們選擇不同的實驗動物及方法對其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探討，但機(jī)制仍不清楚，主要的機(jī)制認(rèn)為與氧自由基、肌鈣

2、蛋白降解及鈣假說有關(guān)。早有大量研究證明缺血再灌注可以誘導(dǎo)基因表達(dá)的改變，而這種改變正是心肌頓抑的分子學(xué)基礎(chǔ)。了解心肌頓抑時有哪些基因的表達(dá)改變，不僅可以揭示缺血再灌注所導(dǎo)致的心肌頓抑的分子學(xué)機(jī)制，還可以通過靶目標(biāo)基因的基因治療抑制心肌頓抑的機(jī)械功能障礙而發(fā)揮心肌頓抑自我修復(fù)功能，這可能是今后缺血性心臟病治療的突破口。雖然有各種針對心肌頓抑的基因表達(dá)改變的研究，但往往局限于幾個或數(shù)十個，對大量基因表達(dá)改變的研究需要新的方法學(xué)，基因芯片是伴

3、隨著人類基因組計劃發(fā)展起來的一項高通量篩選技術(shù)，它能在同一實驗條件下同時篩檢數(shù)以千萬計的基因的差異表達(dá)，因此，基因芯片技術(shù)的高效性和可靠性為研究心肌頓抑相關(guān)基因的表達(dá)變化提供了新的技術(shù)手段。
　　 心肌頓抑的特點(diǎn)在于其潛在的可恢復(fù)性，因此有人認(rèn)為治療一個可能自我痊愈的病理生路過程沒有必要。但研究證明反復(fù)的心肌頓抑可以引起心肌冬眠，并從而導(dǎo)致心力衰竭，因此及時有效地治療心肌頓抑對預(yù)防慢性心力衰竭的形成和發(fā)展是有重大意義的。多數(shù)研究

4、已經(jīng)證實，再灌注時細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌頓抑的主要原因。目前，預(yù)防細(xì)胞內(nèi)鈣超載的有效藥物之一是鈣拮抗劑。地爾硫卓是一類能選擇性地阻滯Ca2+經(jīng)細(xì)胞膜上慢鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，另外，地爾硫卓作為鈣拮抗劑可作用于外周血管平滑肌使血管舒張，降低血管阻力，減輕后負(fù)荷，使心輸出量增加，心肌的氧耗減少，減輕心肌頓抑。因此鈣離子拮抗劑有望逆轉(zhuǎn)這種異常從而治療心肌頓抑。
　　 研究目的
　　 探討心肌頓抑的差異表達(dá)

5、基因，分析其功能以探討心肌頓抑可能的分子學(xué)機(jī)制以便為今后的基因治療提供目標(biāo)基因；觀察鈣拮抗劑地爾硫卓不同時間左心室直接注入對大鼠心肌頓抑的療效。
　　 研究方法
　　 1.采取大鼠開胸前降支結(jié)扎20分鐘再灌注120分鐘方法制造心肌頓抑模型；
　　 2.取大鼠頓抑及假手術(shù)組前壁心肌提取總RNA，采用北京博奧生物有限公司的27K Rat Genome Array芯片掃描觀察差異表達(dá)的基因。
　　 3.選擇基因

6、芯片差異表達(dá)倍數(shù)高的基因進(jìn)行熒光PCR驗證確定芯片檢測結(jié)果的可靠性。
　　 4.應(yīng)用地爾硫卓在缺血前、再灌注即刻、再灌晚期左心室注射觀測其對頓抑大鼠心肌功能的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.大鼠心肌頓抑模型的制造。
　　 心肌頓抑組與假手術(shù)組比較在缺血及再灌注后出現(xiàn)心率增快，LVSP、LVDP、LV±dp/dtmax降低，心肌酶無明顯升高。
　　 2.心肌頓抑時基因表達(dá)的變化
　　 基因芯片

7、檢測頓抑組與假手術(shù)組心肌差異表達(dá)的基因有292條，其中199條上調(diào)，93條下調(diào)。為便于進(jìn)一步分析基因功能及意義，我們進(jìn)一步以4倍差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)篩選出表達(dá)豐度較高的基因41條，以芯片中表達(dá)倍數(shù)較高的HSP70、PAI-1、ATF-3、c-FOS與看家基因GADPH做對照，用RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)在RT-PCR驗證中表達(dá)倍數(shù)雖然不相同，但兩者總體的表達(dá)趨勢是相同的，認(rèn)為芯片的篩查結(jié)果是可靠的。其中上調(diào)幅度最大為23.1倍，進(jìn)一步提高篩選標(biāo)準(zhǔn)后

8、表達(dá)下調(diào)的基因無入選。對表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行功能分類有以下幾種：1、熱休克蛋白。2、立即早期基因。3、生長因子。4、凋亡相關(guān)基因。5、其他如炎癥相關(guān)因子。
　　 3.地爾硫卓不同時間點(diǎn)左心室注射對頓抑心肌功能的影響
　　 與假手術(shù)組比較，其他各組在缺血及再灌注20分鐘后均出現(xiàn)心率增快，LVSP、LVDP、LV±dp/dtmax降低(P<0.05)；與心肌頓抑組比較，缺血期注射地爾硫卓組再灌注60分鐘時LV±dp/dtmax

9、明顯改善(P<0.05)，再灌注90分鐘時LVSP、LVDP明顯改善(P<0.05)，至再灌注120分鐘時LV±dp/dtmax基本恢復(fù)至缺血前水平；而再灌注早期注射地爾硫卓組在再灌注90分鐘LV±dp/dtmax明顯改善(P<0.05)，再灌注120分鐘時LVSP、LNDP明顯改善(P<0.05)；而再灌注晚期注射地爾硫卓組在再灌注后INSP、LVDP、LV±dp/dtmax無明顯改善(P>0.05)。
　　 結(jié)論