胃癌基因芯片差異表達基因的驗證和篩選.pdf

1、背景：胃癌的發(fā)病率和死亡率很高，目前缺乏有效的診治手段?；蛐酒侨媪私馕赴┑陌l(fā)生發(fā)展機制，篩選生物學標志物的重要手段，但要從中篩選出有價值的指標需要多方面的驗證分析。 目的：從基因芯片中篩選有價值的差異表達基因。方法：1、挑選8個基因芯片實驗中顯示的胃癌差異表達基因，加S100蛋白家族中S100A2，S100A4，AKR1C2共¨個基因，用RT-PCR和REAL-TIMEPCR方法分析這11個感興趣基因在22例新鮮胃癌組織及

2、對應的正常胃黏膜組織的差異表達。 2、構建包含208例1020個組織點有預后資料胃癌患者的組織芯片，每一例患者組織均進行配對設計。 3、用免疫組化方法檢測了S100A2，S100A4，S100A6蛋白在胃癌芯片中的表達，構建正義以及反義FAM3B基因的CRNA探針，用原位雜交方法檢測了它在胃癌芯片中的表達。分析上述基因與胃癌臨床病理指標以及預后的相關性。 4、構建S100A2干擾載體，通過瞬時轉染，RT-PCR和

3、WESTERN檢測篩選了S100A2基因的有效干擾序列。 結果：1、RT-PCR和REAL-TIMEPCR驗證的8個基因中，與基因芯片結果一致的基因有5個，它們是：S100A6，IGFBP4，AKR1C2，FAM3B，SAFB1，CKBB。吻合率為62.5％。以BETA-MICROGLOBIN為內標，用REAL-TIMEPCR定量分析了S100A2，S100A4，S100A6基因表達，他們在胃癌中表達升高的比率分別為80％，55

4、％，74％。表達升高的倍數分別為：10.78，2.31，2.25倍。它們相對于β2-microglobulin表達豐度分別為2.83E-04，6.44E-02，0.41。 2、成功構建了胃癌轉移以及預后組織芯片，共1020點，組織點有效率為98％。 3、免疫組化顯示，正常胃黏膜，癌灶，淋巴結轉移灶S100A2，S100A4，S100A6陽性表達率逐漸升高，依次為9.6％/32.2％/43.5％，9.4％/28.1％/32

5、.2％，34.3％/84.1％/90.9％。三個分子在癌灶和淋巴結轉移灶中的表達陽性率均高于對應正常胃黏膜(P＜0.05)。正常組織中S100A2的表達僅與脈管癌栓有關，有脈管癌栓正常組織中S100A2表達高于無脈管癌栓者，差異具有顯著性(P=0.0017)。腫瘤組織中S100A2表達僅與TNM分期有關，Ⅰ期表達最低，其余0期，Ⅱ期，Ⅲ期表達均高于Ⅰ期，差異具有顯著性(P=0.05)。淋巴結轉移灶中S100A2的表達僅在不同年齡組間存在

6、差異，中青年齡組表達高于老年組((P=0.004)。轉移淋巴結灶中S100A2高表達者與低表達者相比，預后傾向更差(P=0.07)。正常組織中S100A4表達與各臨床病理因素未發(fā)現相關。腫瘤組織中S100A4表達僅與浸潤深度相關，浸潤至肌層和漿膜層的胃癌表達高于僅浸潤黏膜和黏膜下層者(P=0.014)。轉移淋巴結中S100A4表達與浸潤深度有關，隨浸潤深度增加表達增加，差異具有顯著性(P=0.013)。此外，雖然差異無顯著性，但隨胃癌T

7、NM分期的進展，S100A4在轉移淋巴結表達有增高趨勢(P=0.054)。S100A4在癌灶中和淋巴結轉移灶中的表達陽性率隨胃癌浸潤深度進展而增加(P=0.014，0.013)，癌灶中S100A4表達高者預后差(P=0.034)，淋巴結轉移灶中S100A4表達高者預后差(P=0.002)。S100A6在65.5％的胃癌患者中表達升高。正常胃黏膜中S100A6表達僅在不同年齡組中有差異，老年組S100A6表達高于中青年組(P=0.022)

8、。癌灶中S100A6表達與腫瘤大小和浸潤深度相關，腫瘤越大，表達越高(P=0.022)，浸潤越深，表達越高(P=0.013)。轉移淋巴結中S100A6的表達僅在不同部位發(fā)生的腫瘤中存在差異，胃竇部的腫瘤轉移的淋巴結中表達高于胃體和賁門癌轉移的淋巴結(P=0.024)。S100A6表達與預后無關，但腫瘤灶與對應正常胃黏膜相比，如果S100A6表達升高，預后比S100A6表達下降者差。S100A2與S100A6之間以及S100A2與S100

9、A4之間在四個層次表達均有相關性。S100A4與S100A6之間僅有弱相關. 4、FAM3B在81.5％胃癌中表達下降。以灰度值8.0為界值，分為陰性和陽性，從正常胃黏膜至轉移淋巴結，FAM3B陽性率依次降低，差異具有顯著性(P=0.000)。正常胃黏膜中FAM3B表達與各臨床病理因素無相關性。腫瘤組織FAM3B表達與浸潤深度和TNM分期有關。局限在黏膜和黏膜下層浸潤者FAM3B表達高與已經浸潤至肌層和漿膜層者，差異具有顯著性(

10、χ2=9.546，P=0.008)；0期胃癌FAM3B表達高于Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期。(χ2=7.866，P=0.049)。三種組織中FAM3B表達以及表達改變程度對胃癌預后的影響沒有顯示出統計學差別，但FAM3B表達高者預后有好于表達低者的趨勢(P值分別為0.057，0.129，0.052)。 5、單因素分析表明胃癌預后的影響因素有：腫瘤病灶大小，組織學類型，浸潤深度，淋巴結轉移，TNM分期，腫瘤灶中S100A4表達水平，轉移淋巴結中S

11、100A4表達水平能夠對胃癌預后產生影響。多因素分析表明腫瘤病灶大小、淋巴結轉移，TNM分期以及正常組織FAM3B表達水平是胃癌預后的獨立影響因素，FAM3B具有保護作用。分析淋巴結轉移的患者預后表明腫瘤大小，轉移淋巴結中S100A4表達水平以及正常組織FAM3B表達水平是獨立影響因子。 6、利用干擾載體瞬時轉染SGC-7901，通過RT-PCR，WESTERN檢測篩選一個S100A2高效干擾的靶位點，并制備了S100A2cRN

12、A探針，為后續(xù)研究S100A2基因功能打下基礎。 結論：1、用RT-PCR以及REAL-TIMEPCR驗證了基因芯片的結果，REAL-TIMEPCR提供了精確定量的手段，為后續(xù)從血液水平檢測胃癌患者基因改變提供了強有力手段。 2、成功構建了大樣本的胃癌轉移以及預后的配對組織芯片，該芯片能夠用于快速篩選與胃癌進展相關的基因，并提供基因的定位信息。 3、S100A6是胃癌細胞高表達基因，FAM3B是胃癌細胞低表達基因