甲基丙烯酸甲酯單體對腫瘤細胞毒性的實驗研究.pdf

1、目的：探討甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate，MMA）單體對A549肺癌細胞有無細胞毒性、毒性分級及表現(xiàn)形式。
　　 方法：1.體外增殖的A549肺癌細胞，以1×104/孔的密度培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，使用MTT比色法連續(xù)7天測量細胞吸光值（optical density，OD），了解正常情況下細胞增殖特點及生長曲線。2.將體外培養(yǎng)的A549肺癌細胞以1×104/孔密度接種于96孔板，分9個MMA單體濃度組（0.

2、01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL）進行培養(yǎng)，另設(shè)陰性對照組（不含MMA單體）。分別在加入MMA單體后30min及第1、3、5天采用MTT比色法測定其OD值，根據(jù)OD值計算細胞相對存活率。3.使用6孔培養(yǎng)板及清潔載玻片制作貼壁細胞爬片模型，設(shè)9個MMA單體濃度組（0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、1

3、0μ/mL、25μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL）、陰性對照組（不含MMA單體）及純MMA單體組。在加入不同濃度MMA單體24h后及加入純MMA單體30s后進行細胞HE染色，觀察不同濃度MMA單體接觸細胞后的細胞形態(tài)學改變。4.以普通25mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)A549細胞，設(shè)置1μg/mL、10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL5個MMA單體濃度組及陰性對照組（不含MMA單體），在加入不同濃

4、度單體24h后，將每組細胞分成3管（密度為5×lO5/管），使用AnnexinV/PI雙染法測試細胞凋亡、壞死的百分比，同時將細胞懸液滴加于載玻片，在熒光顯微鏡下進行觀察。
　　 結(jié)果：1.A549細胞在鋪板后前4天呈對數(shù)生長趨勢，4-6天之間處于平臺期，6天后開始下降。2.加入不同濃度MMA單體30min后，各濃度組間OD值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。第1、3、5天各濃度組間OD值差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在各

5、時間的OD值的統(tǒng)計中，0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL組OD值與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。25μg/mL、40μg/mL、80μg/mL及120μg/mL組各時間點OD值隨濃度升高呈下降趨勢，與對照組OD值差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其中10μg/mL組與40μg/mL組、80μg/mL，組及120μg/mL組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但與25μg/mL組差異無統(tǒng)計學意義。第5

6、天25μg/mL組與80μg/mL組及120μg/mL組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但80μg/ml_，組與120μg/mL組差異無統(tǒng)計學意義。根據(jù)6級毒性分級法，各時間點OD值測量顯示，MMA單體濃度在120μg/mL內(nèi)對A549細胞的最大毒性分級為2級。其中第1天、第3天除120μg/mL組細胞毒性為2級外，剩余8組細胞毒性均在0-1級，第5天時40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL組細胞毒性為2級，剩余6組細胞毒性

7、均在0-1級。3.細胞HE染色顯示A549細胞與MMA單體接觸24h后，40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL組可見部分細胞核結(jié)構(gòu)不清，核濃縮。純MMA單體與細胞直接接觸30s后，可見大量細胞壞死，散在分布，大多數(shù)細胞無正常細胞形態(tài)，核結(jié)構(gòu)不清，部分漂浮，細胞膜消失、胞漿溶解。④A549細胞與MMA單體接觸24h后，各濃度組間細胞凋亡及壞死百分比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。1μg/mL組與對照組細胞凋亡及壞死百分比差異無

8、統(tǒng)計學意義（P>0.05），細胞凋亡與壞死比例相近在10μg/mL時細胞壞死百分比達到對照組兩倍，此后隨單體濃度升高而逐漸升高，10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL組細胞壞死比例均高于凋亡比例，在120μg/mL時細胞壞死及凋亡比例達最高值。熒光顯微鏡下可見：細胞散在分布，凋亡細胞呈現(xiàn)綠色熒光，壞死細胞呈現(xiàn)紅色熒光。
　　 結(jié)論：1.低濃度MMA單體及與細胞短暫的接觸時間不會對體外培養(yǎng)的A549細胞產(chǎn)

9、生明顯毒性作用。2.隨單體濃度升高以及單體與細胞接觸時間的延長，單體對細胞增殖的抑制逐漸明顯。當單體濃度在40μg/mL_，范圍內(nèi)時對細胞生長相對安全，當濃度超過40μg/mL，細胞毒性隨單體濃度及細胞與單體接觸時間的延長而增加。當單體濃度在120μg/mL范圍內(nèi)時最大細胞毒性不超過2級。純MMA單體接觸腫瘤細胞可立即導致細胞壞死。3.MMA單體有誘導腫瘤細胞凋亡和壞死的作用，這種誘導作用隨單體濃度增加而明顯。單體濃度較低時與對照組差異