甲基丙烯酸甲酯單體對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate，MMA）單體對(duì)A549肺癌細(xì)胞有無細(xì)胞毒性、毒性分級(jí)及表現(xiàn)形式。
　　 方法：1.體外增殖的A549肺癌細(xì)胞，以1×104/孔的密度培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，使用MTT比色法連續(xù)7天測(cè)量細(xì)胞吸光值（optical density，OD），了解正常情況下細(xì)胞增殖特點(diǎn)及生長(zhǎng)曲線。2.將體外培養(yǎng)的A549肺癌細(xì)胞以1×104/孔密度接種于96孔板，分9個(gè)MMA單體濃度組（0.

2、01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL）進(jìn)行培養(yǎng)，另設(shè)陰性對(duì)照組（不含MMA單體）。分別在加入MMA單體后30min及第1、3、5天采用MTT比色法測(cè)定其OD值，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。3.使用6孔培養(yǎng)板及清潔載玻片制作貼壁細(xì)胞爬片模型，設(shè)9個(gè)MMA單體濃度組（0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、1

3、0μ/mL、25μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL）、陰性對(duì)照組（不含MMA單體）及純MMA單體組。在加入不同濃度MMA單體24h后及加入純MMA單體30s后進(jìn)行細(xì)胞HE染色，觀察不同濃度MMA單體接觸細(xì)胞后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。4.以普通25mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)A549細(xì)胞，設(shè)置1μg/mL、10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL5個(gè)MMA單體濃度組及陰性對(duì)照組（不含MMA單體），在加入不同濃

4、度單體24h后，將每組細(xì)胞分成3管（密度為5×lO5/管），使用AnnexinV/PI雙染法測(cè)試細(xì)胞凋亡、壞死的百分比，同時(shí)將細(xì)胞懸液滴加于載玻片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
　　 結(jié)果：1.A549細(xì)胞在鋪板后前4天呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì)，4-6天之間處于平臺(tái)期，6天后開始下降。2.加入不同濃度MMA單體30min后，各濃度組間OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第1、3、5天各濃度組間OD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在各

5、時(shí)間的OD值的統(tǒng)計(jì)中，0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL組OD值與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。25μg/mL、40μg/mL、80μg/mL及120μg/mL組各時(shí)間點(diǎn)OD值隨濃度升高呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中10μg/mL組與40μg/mL組、80μg/mL，組及120μg/mL組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但與25μg/mL組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第5

6、天25μg/mL組與80μg/mL組及120μg/mL組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但80μg/ml_，組與120μg/mL組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)6級(jí)毒性分級(jí)法，各時(shí)間點(diǎn)OD值測(cè)量顯示，MMA單體濃度在120μg/mL內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞的最大毒性分級(jí)為2級(jí)。其中第1天、第3天除120μg/mL組細(xì)胞毒性為2級(jí)外，剩余8組細(xì)胞毒性均在0-1級(jí)，第5天時(shí)40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL組細(xì)胞毒性為2級(jí)，剩余6組細(xì)胞毒性

7、均在0-1級(jí)。3.細(xì)胞HE染色顯示A549細(xì)胞與MMA單體接觸24h后，40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL組可見部分細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不清，核濃縮。純MMA單體與細(xì)胞直接接觸30s后，可見大量細(xì)胞壞死，散在分布，大多數(shù)細(xì)胞無正常細(xì)胞形態(tài)，核結(jié)構(gòu)不清，部分漂浮，細(xì)胞膜消失、胞漿溶解。④A549細(xì)胞與MMA單體接觸24h后，各濃度組間細(xì)胞凋亡及壞死百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。1μg/mL組與對(duì)照組細(xì)胞凋亡及壞死百分比差異無

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），細(xì)胞凋亡與壞死比例相近在10μg/mL時(shí)細(xì)胞壞死百分比達(dá)到對(duì)照組兩倍，此后隨單體濃度升高而逐漸升高，10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL組細(xì)胞壞死比例均高于凋亡比例，在120μg/mL時(shí)細(xì)胞壞死及凋亡比例達(dá)最高值。熒光顯微鏡下可見：細(xì)胞散在分布，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。
　　 結(jié)論：1.低濃度MMA單體及與細(xì)胞短暫的接觸時(shí)間不會(huì)對(duì)體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞產(chǎn)

9、生明顯毒性作用。2.隨單體濃度升高以及單體與細(xì)胞接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，單體對(duì)細(xì)胞增殖的抑制逐漸明顯。當(dāng)單體濃度在40μg/mL_，范圍內(nèi)時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)安全，當(dāng)濃度超過40μg/mL，細(xì)胞毒性隨單體濃度及細(xì)胞與單體接觸時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。當(dāng)單體濃度在120μg/mL范圍內(nèi)時(shí)最大細(xì)胞毒性不超過2級(jí)。純MMA單體接觸腫瘤細(xì)胞可立即導(dǎo)致細(xì)胞壞死。3.MMA單體有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死的作用，這種誘導(dǎo)作用隨單體濃度增加而明顯。單體濃度較低時(shí)與對(duì)照組差異